【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

owanaka[使用道具]
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4041

发表于 2013-3-18 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师你好，我做的是15KDa的蛋白，开始还有条带，但后来换了个实验室就经常空白，有也很不清楚。实在是不知道什么原因，胶也染过，膜也染过，感觉都没什么大问题啊。

我用的是bio-rad的半干转仪，条件是12v，60ma，30min。上下十层滤纸。NC膜。每个大小约8cm2。我知道这个跟您说的条件有不同，但是我以前用这个条件也是出条带的，而且很清晰。maker也转的非常清楚啊。

难道是我的NC膜有问题？或者是我的蛋白样品出了问题？

还有就是，我的内参也出来的，就是比较淡，所以才考虑是不是蛋白样品量的问题，但是按照计算，我每个孔加样的总蛋白早超过50ug了，是不是因为经常冻融和使用，样品出问题？

PINK[使用道具]
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4042

发表于 2013-3-18 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了

memory[使用道具]
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4043

发表于 2013-3-18 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在做配制做胞浆、胞核抽提试剂的时候分离过。提取的是胞核组分做的，PARP-1效果一般

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如果提取蛋白时，胞浆和胞核蛋白不分开提，可以吗？即最终的蛋白提取液里，既有核蛋白，也有胞浆蛋白，这样的提取方法你用过没有？

S6044[使用道具]
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4044

发表于 2013-3-18 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问120kd的蛋白，转膜条件是什么？

youyou99[使用道具]
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4045

发表于 2013-3-18 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了

==========================================================================

有可能这个是低表达的蛋白，或者根本没有表达这个蛋白。尝试阳性标本检查是否为抗体原因

youyou99[使用道具]
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4046

发表于 2013-3-18 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了
有可能这个是低表达的蛋白，或者根本没有表达这个蛋白。尝试阳性标本检查是否为抗体原因

===========================================

这几种细胞都是阳性标本，都含有大量的胶原。
但不知为什吗就是做不出来130KD和300KD的条带。

jrwyyplt[使用道具]
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4047

发表于 2013-3-18 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

10%的脱脂奶粉不会有什么问题
我怀疑你重复使用一抗

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请问楼主，是不是不可以重复使用一抗？还有就是：我现在正在做一个膜蛋白的WB，分子量是120KD，表达量比较低，提的是总蛋白，转膜条件：湿转：250mA，2.5h，有时候用200mA，3h，也试过半干转：100mA，40-50min，可是一直没出条带，或者有疑似条带出现，每次actin都有，每次都是以失败告终，请楼主给点建议。

nn255[使用道具]
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4048

发表于 2013-3-18 12:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有一个的问题请老师答疑一下：
如何确保内参一致？
我的样品提取后用考马斯亮蓝蛋白定量，然后调浓度一致，但是上样跑内参结果条带灰度值却不一致，肉眼看差异都很明显。蛋白定量还有意义吗？
但是根据这次的结果灰度值调节一下上样量，再跑内参，还是不太一致。所以到底该如何确保内参一致？

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4049

发表于 2013-3-18 12:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
肝癌
楼主您好：我一直在做肝癌细胞的雌激素受体、磷酸化雌激素受体、MMP9、NF-KB，很不稳定，做出过一两次，而且条带很浅。但是b-actin做的蛮好的。
我的wb条件：
细胞制备
配胶、电泳
转膜：转膜我没完全按照园子里说的那种三明治做法，我是金字塔形的做法，怕不仪器弄短路了。17v，20-30min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（bioworld，稀释液用的是碧云天的成品）
TBST洗涤10min*3次
二抗室温1小时
TBST洗涤10min*3次
ECL显色1-2分钟
结果是背景很浅，就再没什么其他的了？我也是个新手，也是一个人做实验，没有人指导，我尝试改变过抗体稀释度，封闭时间，ECL时间，增加上样量，就是没有效果。谢谢您给一些指导和意见！

IAM007[使用道具]
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4050

发表于 2013-3-18 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主您好：我在做肝癌细胞WB,其中一种蛋白结果很奇怪。目的蛋白31kDa左右
我的wb条件：
新鲜抽提的蛋白
新鲜配制的胶12%和电泳液
湿法转膜220mA，40min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（sigma 1:500，太高，后又用过1:1000，还是老问题，稀释液用的是封闭液）
PBST洗涤10min*3次
二抗室温1.5小时（稀释液用的牛奶）
PBST洗涤10min*3次
ECL显色10s
结果如图。这个问题并非每次都出现，使用同样的抗体和样品，条件也不变，有时出现，有时正常，请楼主看看，万分感谢

附件

2013-3-18 12:44

33540117.jpg (8.21 KB)

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