蛋白质与蛋白组学

有一个的问题请老师答疑一下：
如何确保内参一致？
我的样品提取后用考马斯亮蓝蛋白定量，然后调浓度一致，但是上样跑内参结果条带灰度值却不一致，肉眼看差异都很明显。蛋白定量还有意义吗？
但是根据这次的结果灰度值调节一下上样量，再跑内参，还是不太一致。所以到底该如何确保内参一致？

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蛋白定量当然有意义

首先要保证蛋白定量的尽量准确

楼主您好：我一直在做肝癌细胞的雌激素受体、磷酸化雌激素受体、MMP9、NF-KB，很不稳定，做出过一两次，而且条带很浅。但是b-actin做的蛮好的。
我的wb条件：
细胞制备
配胶、电泳
转膜：转膜我没完全按照园子里说的那种三明治做法，我是金字塔形的做法，怕不仪器弄短路了。17v，20-30min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（bioworld，稀释液用的是碧云天的成品）
TBST洗涤10min*3次
二抗室温1小时
TBST洗涤10min*3次
ECL显色1-2分钟
结果是背景很浅，就再没什么其他的了？我也是个新手，也是一个人做实验，没有人指导，我尝试改变过抗体稀释度，封闭时间，ECL时间，增加上样量，就是没有效果。谢谢您给一些指导和意见！

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你说的这些蛋白我都做过

1、自己配制一抗稀释液

2、注意TBST的pH值，7.0-8.0之间，尽量配制成8.0

3、ECL是哪里的？

楼主您好：我在做肝癌细胞WB,其中一种蛋白结果很奇怪。 目的蛋白31kDa左右
我的wb条件：
新鲜抽提的蛋白
新鲜配制的胶12%和电泳液
湿法转膜220mA，40min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（sigma 1:500，太高，后又用过1:1000，还是老问题，稀释液用的是封闭液）
PBST洗涤10min*3次
二抗室温1.5小时 （稀释液用的牛奶）
PBST洗涤10min*3次
ECL显色10s
结果如图。这个问题并非每次都出现，使用同样的抗体和样品，条件也不变，有时出现，有时正常，请楼主看看，万分感谢

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出现什么现象呢？

蛋白定量当然有意义

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首先要保证蛋白定量的尽量准确
根据内参的条带反过来微调上样量为什么还是不能保证内参的一致呢？

你说的这些蛋白我都做过

1、自己配制一抗稀释液

2、注意TBST的pH值，7.0-8.0之间，尽量配制成8.0

3、ECL是哪里的？

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谢谢老师！

1.我以前用过PBS稀释一抗的，没有一抗稀释液的配方，望老师给我发一份

2.TBST保持在7.5左右，我将把它调到8.0

2.ECL是碧云天生产的

3.我的转膜时间会不会长了啊？听讲会转过了（我用的是半干法）

根据内参的条带反过来微调上样量为什么还是不能保证内参的一致呢？

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这个整个过程中的操作手法有很大关系

因为WB的灵敏度是有线性范围的

现象是目的条带的稍下方会出现一条横贯NC膜的条带，甚至延伸至marker泳道，影响我的实验结果

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做一个抗体由这种现象

还是做所有的抗体都有这种现象？

谢谢老师！

1.我以前用过PBS稀释一抗的，没有一抗稀释液的配方，望老师给我发一份

2.TBST保持在7.5左右，我将把它调到8.0

2.ECL是碧云天生产的

3.我的转膜时间会不会长了啊？听讲会转过了（我用的是半干法）

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转膜时间没问题

试试Millipore的ECL吧，货号：WBKLS0100

转膜时间没问题

试试Millipore的ECL吧，货号：WBKLS0100

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谢谢老师！

Millipore的现在没货。用PIERCE的先试试，希望自己有好运