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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，我做的是“还原胶电泳”我要看该蛋白“脱偶联”情况，蛋白上样前不不能煮的
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发表于 2013-1-30 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白 为组成型

大小 二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5％
转膜条件为：400mA 80分钟（转膜效果差）

5％脱脂奶粉封闭 RT 1 h

洗脱3次每次5分钟

一抗为1：200－1：1000
二抗为1：4000
ECL 反应2 min
曝光2 min-overnight
不能看到 二聚体或者亚基的任何一条带
请问我的问题出现在那里？怎么解决？
谢谢

===========================================================================================

既然你的总蛋白要求不能煮，就代表不能用变性胶跑电泳，所以是不是应该用Native page胶。个人意见，仅供参考。
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发表于 2013-1-30 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，我做的是“还原胶电泳”我要看该蛋白“脱偶联”情况，蛋白上样前不不能煮的，

========================

还原怎么不能煮？
还原一般都是要煮的
我不清楚你的目的蛋白信息
建议你多查查相关文献
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发表于 2013-1-30 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你上样的时候总蛋白含量太低了
另外这么小的蛋白用0.22um孔径的膜
转膜建议用半干转

==================================================================================================

请问用0.22um孔径的膜和0.45um孔径的膜对15KD有什么区别？我们实验室只有0.45um的膜。我们实验室也没有半干转设备。
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发表于 2013-1-30 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

弱弱的问下，EQU307转膜仪怎么用啊，BBI产的。它的冷却系统跟BIO-RAD的不一样。我不知道怎么用？请高手指点！
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发表于 2013-1-30 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我网上查过tricine系统，好像有些用的是2004年暨南大学曹老师的一篇文献里的配方，但是很多都出现了不同状况的问题，楼主有没有用过tricine系统？谢谢
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发表于 2013-1-30 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我现在在做的是大鼠大脑中的NMDAR,用的是抗NMDAR2A/B的抗体，分子量是165kd。可是就是不出结果，我在想是不是因为我的目的蛋白表达的量本来就比较少啊！期待你的答案，很着急
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发表于 2013-1-30 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我想向您请教一下糖基化蛋白的western 问题，我做一种糖基化蛋白，有高糖型和低糖型，但是每次ecl显色都会发生不同的结果，有的时候两种糖型都能够出现，有的时候反而只能发出高糖型，不知道是ECL的问题还是抗体的问题，我的一抗用的是santa的。谢谢！
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发表于 2013-1-30 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问用0.22um孔径的膜和0.45um孔径的膜对15KD有什么区别？我们实验室只有0.45um的膜。我们实验室也没有半干转设备。

=====================================

0.45um孔径的膜与0.22um膜的截留能力不同
15KD的蛋白，用0.45um的膜容易使蛋白穿透
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 小中大
弱弱的问下，EQU307转膜仪怎么用啊，BBI产的。它的冷却系统跟BIO-RAD的不一样。我不知道怎么用？请高手指点！

===============

非常不好意思
我没用过这个仪器
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