【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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421

发表于 2013-1-30 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我网上查过tricine系统，好像有些用的是2004年暨南大学曹老师的一篇文献里的配方，但是很多都出现了不同状况的问题，楼主有没有用过tricine系统？谢谢

================

没用过
但是看过相关的文献
问题应该不是很大
仔细研读文献
最好看英文的

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422

发表于 2013-1-30 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我现在在做的是大鼠大脑中的NMDAR,用的是抗NMDAR2A/B的抗体，分子量是165kd。可是就是不出结果，我在想是不是因为我的目的蛋白表达的量本来就比较少啊！期待你的答案，很着急

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首先要查找文献
确认你的目的蛋白能够提取出来

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423

发表于 2013-1-30 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好，我想向您请教一下糖基化蛋白的western 问题，我做一种糖基化蛋白，有高糖型和低糖型，但是每次ecl显色都会发生不同的结果，有的时候两种糖型都能够出现，有的时候反而只能发出高糖型，不知道是ECL的问题还是抗体的问题，我的一抗用的是santa的。谢谢！

========================

抗体反复用了吗？
我认为最大的可能是一抗反复用
另外是样品的冻融

duoduo[使用道具]
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424

发表于 2013-1-30 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好，
我跑了P-ERK，不知为何结果出现三条带，一抗用的是CST 的，1：1000，4度过夜，第二天摇了两小时后，二抗1：1000，摇了3个半小时，
结果如下，MAKE是上面的55，下面的35，感觉最下面的应该是非特异的，但它条带这么深，不知道什么原因？请求帮助。

duoduo[使用道具]
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425

发表于 2013-1-30 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有这个是我前几天跑的也有这样的情况，区别就是下面的一抗不是新的，反复用过几次，但我早些时候跑的下面的那个条带就谈一些，不知道是原因，请求帮助中

utt0989[使用道具]
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426

发表于 2013-1-30 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问,我做这个蛋白17kd.我原来用的是30%的ACR/BIS,也试过40%的。我想问一下对这种小蛋白用哪一个好？还有就是单克隆抗体是在封闭液里面稀释好还是在TBST里面稀释好？最后一个问题：我用的是NC膜，一抗孵育之后洗膜有什么需要值得注意的地方？

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427

发表于 2013-1-30 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

插一个问题，封闭夜是不是要同时加脱脂奶粉和BSA？

avi317[使用道具]
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428

发表于 2013-1-30 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的抗体是单抗，丰度不高，一抗用TBST稀释相同浓度和封闭液比较，前者有条带，后者没有。稀释液中有叠氮化钠之类的，有防腐等作用，但是影响抗体的活性。个人建议：如果是多抗用封闭液稀释好些，如单抗，丰度低者用TBST稀释好些，因封闭液封闭后背景不会很高的，这样可能更容易W出结果。个人观点，仅供参考，我也是新手，这是一小点经验吧，你批判接受就好，希望有用！

呵呵
稀释液中有叠氮钠你就敢下这样的结论？

让楼主见笑啦。这样的结论也是在园子里和文献中学到的，也许偏驳吧！但是我的实验的确证实抗体稀释液对抗体活性有影响，在组化及W中我都对照过，当然具体机制可能不是叠氮化钠。不过任何实验都只是无穷可能中一种，我是新手，实践的可能性更少，仅供参考吧，希望有用！

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429

发表于 2013-1-30 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好，
我跑了P-ERK，不知为何结果出现三条带，一抗用的是CST 的，1：1000，4度过夜，第二天摇了两小时后，二抗1：1000，摇了3个半小时，
结果如下，MAKE是上面的55，下面的35，感觉最下面的应该是非特异的，但它条带这么深，不知道什么原因？请求帮助。

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一抗用1：2000试试
二抗孵育时间用40min

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发表于 2013-1-30 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做这个蛋白17kd.我原来用的是30%的ACR/BIS,也试过40%的。我想问一下对这种小蛋白用哪一个好？还有就是单克隆抗体是在封闭液里面稀释好还是在TBST里面稀释好？最后一个问题：我用的是NC膜，一抗孵育之后洗膜有什么需要值得注意的地方？

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30%的就可以，用15%的分离胶
转移时间要缩短
我选用抗体稀释到封闭液里
NC膜不能干燥

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