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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
插一个问题，封闭夜是不是要同时加脱脂奶粉和BSA？

==========

单一的
用脱脂奶粉
或者BSA
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-1-30 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！我再做NADPH oxidase 中的GP91蛋白一个月多了，内参GADPH很容易做出，但是GP91很难做出来，通常曝光时没有，就是有也要曝光10-15分钟片子上，条带比较弱，因为曝光时内参肉眼清晰可见，但是目标蛋白处肉眼看不出，所以曝光10分钟以上。我认为自己操作还是有问题，请您指教，万分感谢！！！！
1 提蛋白，BCA测浓度，按30 UG上样，
2浓缩胶80V,30分钟，分离胶150V，60分钟以上
3转膜，350MA,100分钟，
4牛奶封闭过夜
5一抗：内参0.2UG,GP91:10UG 摇床4小时
6二抗：都是2UG
7 ECL显影，显影液和定影液都是柯达的
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发表于 2013-1-30 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
17kd的蛋白，200ma 30min和100ma 1h湿转，那个好一点？如果目的蛋白丰度不高的话 可不可以直接曝光30min?
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发表于 2013-1-30 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个问题 ABCAMPROTOCOL讲到叠氮化钠会影响HRP抗体活性，而我的ABCAM一抗就是用PBS+叠氮化钠稀释的，对结果影响大不？
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发表于 2013-1-30 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗用1：2000试试
二抗孵育时间用40min

==============================

我准备最近按你提供的条件再跑一次
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发表于 2013-1-30 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！我再做NADPH oxidase 中的GP91蛋白一个月多了，内参GADPH很容易做出，但是GP91很难做出来，通常曝光时没有，就是有也要曝光10-15分钟片子上，条带比较弱，因为曝光时内参肉眼清晰可见，但是目标蛋白处肉眼看不出，所以曝光10分钟以上。我认为自己操作还是有问题，请您指教，万分感谢！！！！
1 提蛋白，BCA测浓度，按30 UG上样，
2浓缩胶80V,30分钟，分离胶150V，60分钟以上
3转膜，350MA,100分钟，
4牛奶封闭过夜
5一抗：内参0.2UG,GP91:10UG 摇床4小时
6二抗：都是2UG
7 ECL显影，显影液和定影液都是柯达的

==========================

说明你的目的蛋白还是有结果的
加大上样量试试
应该就可以了
分子量多大？
如果分子量与GAPDH差不多
减少转移时间至40min
封闭40min至1h RT
一抗4度过夜
二抗RT 40min至1h
good luck
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发表于 2013-1-30 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
17kd的蛋白，200ma 30min和100ma 1h湿转，那个好一点？如果目的蛋白丰度不高的话 可不可以直接曝光30min?

============================

200ma 30min会好一些
丰度不高的话加大上样量
延长一抗在4度孵育的时间（过夜）
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 小中大
还有一个问题 ABCAMPROTOCOL讲到叠氮化钠会影响HRP抗体活性，而我的ABCAM一抗就是用PBS+叠氮化钠稀释的，对结果影响大不？

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呵呵
抗体保存的时候有很多是用0.09%叠氮钠来保存的
防腐
在孵育的时候稀释抗体了，在整个体系中叠氮钠浓度就比较低了
不会影响活性
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 小中大

电泳时上样蛋白不向下跑,甚至MARKER也不动,是什么原因?电压为100V。
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 小中大
电泳时上样蛋白不向下跑,甚至MARKER也不动,是什么原因?电压为100V。

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这个问题就大了
测定一下缓冲液的pH
包括电泳缓冲液、Tris-HCl等
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