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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-21 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想请教哈 我跑的蛋白电泳MAKER亮度很弱是什么问题了 但是蛋白好像也跑得不是很开 是不是胶的问题很大啊 我按照分子克隆书上配置的 12%的分离胶 5#的浓缩胶

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注意配胶缓冲液的pH
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发表于 2013-3-21 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
OP我最近做Western 目的蛋白的分子量为76KD 配10%的分离胶，5%的浓缩胶跑胶还是很顺利的，Marker（预染蛋白质分子量标准---碧云天公司的）的条带非常清楚，只是在转膜的时候遇到麻烦了，我用的0.45UM的PVDF膜，恒流250mA，时间90分钟，但转完的时候膜和胶都一片空白。Marker找不到了，我疑问了好几天，好几天的心血都白费了，请问我到底哪个环节错了呀？希望楼主给我参考参考，我将会不胜感激。

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胶、膜的位置与电极的位置放反了
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发表于 2013-3-21 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想问问，在做Western之前，提取蛋白样品时，将收的细胞放在-80度冰箱，等几天再定量可以吗？如果可以能放多久？蛋白样品在-20 度中能放多久？

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放在-80度过几天定量是可以的
在-20度不能放，冻了之后，融化，离心就会有沉淀
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发表于 2013-3-21 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，请教一下：我前几天做WB还有结果，昨天把乙酸当甲醇配转膜缓冲液了，结果转膜不成功，今天注意了这个问题，结果marker还是没有怎么转过去，请问有什么情况会导致这种结果啊？谢谢

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什么转膜条件？
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发表于 2013-3-21 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主您好，我用的ECL是碧云天的ECL Plus，前两天做的时候靶蛋白直接压片过夜了，第二天早上显影后条带还很暗，而且背景深。请教一下，300mA转膜2h后43kD的内参会转走吗？0.45的PVDF，谢谢您的解答！

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把内参图放上来
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发表于 2013-3-21 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我有个疑问。western blot转膜后maker上了PVDF膜，但用考马斯亮蓝染胶却发现所有样品蛋白带都在胶上，请问可能是什么原因？我用的210mA跑了2小时.
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发表于 2013-3-21 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

200mA,30min，以前这个条件也做过好久了，都行得通的啊
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发表于 2013-3-21 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验室或者个人的习惯
我们转膜习惯用恒流

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谢谢楼主解答，再请教一个问题，我刚开始做wb不久，每次内参都能曝出来，就是不见目的蛋白，那我的实验步骤是不是应该没问题，问题出在抗体上或者其他的方面，还请楼主指点一二
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发表于 2013-3-21 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把内参图放上来

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版主，您好：
第一张图是内参β-actin的，第二张是我的目的蛋白（132kD）
条件：8%胶跑1h30min
转膜100mA，2h，5%进口奶粉封闭两小时
一抗santa cruze，推荐1:200，稀释范围1:100-1:1000，我用的β-actin按1:2000稀释，目的蛋白1:200稀释，室温摇动孵育2h
二抗碧云天，1:2000稀释，室温摇动孵育1.5h
ECL碧云天的
β-actin条带很好，压片两分钟，目的蛋白是压片过夜的，条带浅，背景深

请问版主：是哪个环节有问题呢？目的蛋白部分没转上？300mA，2h转的话会不会β-actin转掉？

谢谢版主的解答！
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发表于 2013-3-21 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师！我最近跑31kb和21kb蛋白，没有什么结果，抗体是没有什么问题的！师姐能做得出，师姐说我的电转有问题，我的电转仪器是北京六一的，恒压100v 2h ，我用的PVDF膜，请问老师我的蛋白是不是转过了，所以才没有弄出来啊！请问老师我这种蛋白大小转膜的条件应该怎么修改！谢谢！老师！
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