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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-21 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！90KD的蛋白，博乐牌机器，20V，半干转多长时间差不多？谢谢解答！
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发表于 2013-3-21 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我有个疑问。western blot转膜后maker上了PVDF膜，但用考马斯亮蓝染胶却发现所有样品蛋白带都在胶上，请问可能是什么原因？我用的210mA跑了2小时.

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电流不通
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发表于 2013-3-21 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主解答，再请教一个问题，我刚开始做wb不久，每次内参都能曝出来，就是不见目的蛋白，那我的实验步骤是不是应该没问题，问题出在抗体上或者其他的方面，还请楼主指点一二

===============

目的蛋白是什么？
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发表于 2013-3-21 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好：
第一张图是内参β-actin的，第二张是我的目的蛋白（132kD）
条件：8%胶跑1h30min
转膜100mA，2h，5%进口奶粉封闭两小时
一抗santa cruze，推荐1:200，稀释范围1:100-1:1000，我用的β-actin按1:2000稀释，目的蛋白1:200稀释，室温摇动孵育2h
二抗碧云天，1:2000稀释，室温摇动孵育1.5h
ECL碧云天的
β-actin条带很好，压片两分钟，目的蛋白是压片过夜的，条带浅，背景深

请问版主：是哪个环节有问题呢？目的蛋白部分没转上？300mA，2h转的话会不会β-actin转掉？

谢谢版主的解答！

==========

换ECL
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发表于 2013-3-21 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师！我最近跑31kb和21kb蛋白，没有什么结果，抗体是没有什么问题的！师姐能做得出，师姐说我的电转有问题，我的电转仪器是北京六一的，恒压100v 2h ，我用的PVDF膜，请问老师我的蛋白是不是转过了，所以才没有弄出来啊！请问老师我这种蛋白大小转膜的条件应该怎么修改！谢谢！老师！

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转膜后：用丽春红S染膜
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发表于 2013-3-21 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！90KD的蛋白，博乐牌机器，20V，半干转多长时间差不多？谢谢解答！

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1h20min左右
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发表于 2013-3-21 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的蛋白是什么？

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目的蛋白是53kd的核蛋白，电泳是10%的分离胶，电压是80v 40min，120v ，120min，用的是millpour 0.45um的pvdf膜，300mA恒流转1h，明显可见marker全部转到膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4度孵育过夜，曝光用的是碧云天的ECL。请问版主这实验过程有没有什么地方需要改进的，我想问一下一抗孵育真的要用小塑料袋封闭隔绝空气孵育吗，我现在是用一个小盒子装的液体完全覆盖膜这样孵育的，内参每次都做的挺好的，等待版主回音，谢谢！
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发表于 2013-3-21 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师 我用丽春红染色了，没有见到明显的条带！最近我的转膜液是新配的，转膜过程中发热很厉害，转完膜的液体上面有很多泡泡，我转膜仍然用2h 100v ,不知道什么原因，很害怕对转膜有影响。请问老师这个是什么原因引起的呢？我的转移液配方是GLy14.5g, Tris29g, sds1.85g ,甲醇200ml,水定容至1000ml,不知道这样的配方对不对 ，配完摇匀后很多气泡很就都不去，请老师指点迷津！谢谢！
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发表于 2013-3-21 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能不能send一份你们实验室常用的wb的protocol给我，我想看一下是不是我的实验步骤出了问题，目的蛋白一直出不来，学生不尽感激
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发表于 2013-3-21 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的蛋白是53kd的核蛋白，电泳是10%的分离胶，电压是80v 40min，120v ，120min，用的是millpour 0.45um的pvdf膜，300mA恒流转1h，明显可见marker全部转到膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4度孵育过夜，曝光用的是碧云天的ECL。请问版主这实验过程有没有什么地方需要改进的，我想问一下一抗孵育真的要用小塑料袋封闭隔绝空气孵育吗，我现在是用一个小盒子装的液体完全覆盖膜这样孵育的，内参每次都做的挺好的，等待版主回音，谢谢！

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换ECL
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