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标题:【讨论帖】western blot问题解答

zhenxin[使用道具]
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老师你好,
我做的那个蛋白是eNOS,该蛋白具有SDS抗性,我所见资料都用Low Temperature-SDS-PAGE的方法做的 ,她们也都是“非煮的”, 因为一煮的话,该蛋白二聚体就回变性解聚成单体(130KDa)。现在还没解决问题,头发都要白了。
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老师你好,
我做的那个蛋白是eNOS,该蛋白具有SDS抗性,我所见资料都用Low Temperature-SDS-PAGE的方法做的 ,她们也都是“非煮的”, 因为一煮的话,该蛋白二聚体就回变性解聚成单体(130KDa)。现在还没解决问题,头发都要白了。

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把文献发给我看看
这种情况的蛋白我没做过
但是iNOS我以前做过
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831226[使用道具]
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TMB显色法所用溶液的配方是什么?
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mamamiya[使用道具]
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为什么我的条带连成一条线?除了加样时间长和电泳时间长外还有其它原因吗?
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ququer787[使用道具]
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你好,
1、我的MARKER只出来四条带,在溴酚蓝下面还有两条带,是不是降解了?胶肯定没问题。
2、上样缓冲液我用的是DBI公司的,比以前用的颜色浅,是不是质量问题?开盖后不好闻。
3、我用的是1.5MM的胶,以前用1.0MM的能作出来,现在换成厚的反而出不来结果了,厚度有影响么?
4、有没有用过BIO-RAD的MINI PROTEIN的仪器?转膜的条件是什么?
5、用的蛋白酶抑制剂是ROCHE的COCKTAIL,提蛋白后忘了加丄样缓冲液就变性了,变性完再加的上缓。染胶后发现大分子量蛋白特别少,是蛋白酶抑制剂不行,还是组织在低温冰箱时间长(5个月),还是丄样缓冲液没有变性?
自从实验室换了这个仪器后我都没有作出来过,现在连胶都跑不好了,真郁闷!忘楼主不吝赐教:)
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TMB显色法所用溶液的配方是什么

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不好意思
这个我没有用过
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为什么我的条带连成一条线?除了加样时间长和电泳时间长外还有其它原因吗?

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上样量大
样品中离子浓度不合适
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NBA[使用道具]
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你好,
1、我的MARKER只出来四条带,在溴酚蓝下面还有两条带,是不是降解了?胶肯定没问题。
2、上样缓冲液我用的是DBI公司的,比以前用的颜色浅,是不是质量问题?开盖后不好闻。
3、我用的是1.5MM的胶,以前用1.0MM的能作出来,现在换成厚的反而出不来结果了,厚度有影响么?
4、有没有用过BIO-RAD的MINI PROTEIN的仪器?转膜的条件是什么?
5、用的蛋白酶抑制剂是ROCHE的COCKTAIL,提蛋白后忘了加丄样缓冲液就变性了,变性完再加的上缓。染胶后发现大分子量蛋白特别少,是蛋白酶抑制剂不行,还是组织在低温冰箱时间长(5个月),还是丄样缓冲液没有变性?
自从实验室换了这个仪器后我都没有作出来过,现在连胶都跑不好了,真郁闷!忘楼主不吝赐教:)

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1,Marker条带位置与胶浓度大小有关,反复冻融会降解
2,上样缓冲液有没有质量问题就不好说了。不好闻是beta-巯基乙醇
3,胶厚度对结果的影响很大
4,没用过你说的这个仪器,但是对于转膜条带来说应该是一样的
5,没加样品缓冲液就变性的话蛋白质直接可能就结块了,没有SDS不行。组织在低温冰箱-80度,放一年对很多蛋白都没有影响
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remenb[使用道具]
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请问:
15的胶 电泳液用过一次,10 17的marker在电泳2/3的时候出现弥散的情况,曝光出来目的蛋白也是很宽很弥散。还有一个问题 我是用的预染MARKER,曝光10分钟,目的条带的marker也貌似也显像了?
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remenb[使用道具]
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补充一下,电泳的时候没看见10的marker 转膜之后可以看见但是不是一条带 也是分开弥散的
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