蛋白质与蛋白组学

楼主，我想问一下蛋白上样量一致是指体积一致还是质量一致啊？样品蛋白浓度不同如何计算使其上样量一致？

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体积与质量均一致

前辈，您好，这是我今天显影出来的一张片子，看起来真的让人死的心都有了。我隔了大半年都没有做WB了，今天是重新第一次做，所以想请您帮我分析分析可能的原因，我的实验条件如下：
1，上样组成：2XSDS上样缓冲液20微升，蛋白16微升，DTT4微升，但是我有的泳道上的总体积多，有的上的总体积少；
2，电泳时电压为40-80伏；
3，转膜条件，湿转，四张小膜用了两个转膜仪，所以用800MA的电流，前面三张大小在40KD左右所以时间为一个半小时，后一张膜100KD所以时间为三个小时；这里想请问一下，在一个电泳仪中两个转膜仪一起转的话，要不要把电流加倍啊，您平时用的多少毫安的电流转膜？
4，封闭用的5%的脱脂牛奶，4-8度过夜；
5，一抗放在室外10度左右，三个小时，然后再30度半个小时；
6，洗膜PH8.3左右的TBST，5*8次；
7，二抗1：4000一个小时，10度左右；
8，洗膜PH8.3左右的TBST，5*8次；这里还想问一下这个TBST的PH有没有什么影响，多少比较好？
9，曝光时加底物后，荧光很强，感觉整张膜都亮
麻烦您了，万分感激！
我自己分析感觉是蛋白降解了，因为抗体是别人用的，没有问题的，

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样品保存多久了？

我们实验室最近做Western，转印完（湿转）用丽春红染膜（NC）后发现，个别泳道在80KD以上染色就是空白，看不到条带（一般10个泳道会有2、3个泳道是这样），最后ECL显影那个地方就是没有条带！！！！
我们确定不是由于转印时气泡所引起的，而且以前没有出现过这样的情况。转印我们用的是湿转，120v 90min。以前没有任何问题！不知道现在怎么了,

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注意转印的夹子要夹好

其实以前都是这么夹的，3年而且一直没有出现过问题，就是最近实验室出现这个问题，而且实验室其他人也是如此，就是相当于做10次western有5次有问题，头都大了。

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设计实验
排除试剂问题

老师，小妹再次来求救！以前我一直是反复用抗体洗脱液后，膜可以重复4次也没有问题！最近不知为什么重复用第三次的时候就曝不出来东西了！条件一直没有变化，样品也是一样的，上样量也没有变化，最近就是转移液新配的，其他条件没有什么变化！请问老师这到底是怎么回事，怎么突然就不能重复用了呢？第1-2次曝光条带很好，到了第三次就看不到条带了为什么？时间比较紧迫，希望老师能回答！

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与蛋白的表达量也有关系
你以前的重复4次于现在的第三次，检测的都是相同的蛋白？
我们一般不这么多次的stripping

老师你好！我是WB新手，
我的过程是：
1.电泳80v跑完浓缩胶，120v跑分离胶，（考马斯亮蓝染色有蛋白条带）
2.转膜用NC膜，270mv80分，膜上marker很清晰，但丽春红染色什么都没有，
3.5%脱脂奶粉（光明牌）封闭1小时，
4.一抗4度过夜
5.TBST洗膜4次，10分/次，二抗1小时
6.TBST洗膜4次，10分/次，ECL作用5分钟，曝光，
但什么都没有，actin也不出，麻烦给点建议

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用考马斯亮蓝染色过的胶再转膜？