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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-30 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好 我是新手 我买的是ABCOM的一抗体 但是 他没有提供做WB的适合浓度 只是提供了这样一句话 Use at a concentration of 1-2μg/ml, 两个抗体的concentration 分别为2.20mg/ml 0.5mg/ml 请问 这种情况 如何确定1抗的浓度
感激
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发表于 2013-1-30 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：
15的胶 电泳液用过一次，10 17的marker在电泳2/3的时候出现弥散的情况，曝光出来目的蛋白也是很宽很弥散。还有一个问题 我是用的预染MARKER，曝光10分钟，目的条带的marker也貌似也显像了？

=====================================

Marker中有些蛋白会显条带
我个人认为是预染M中的有些蛋白会与抗体结合
延长凝胶时间试试
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发表于 2013-1-30 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好 我是新手 我买的是ABCOM的一抗体 但是 他没有提供做WB的适合浓度 只是提供了这样一句话 Use at a concentration of 1-2μg/ml, 两个抗体的concentration 分别为2.20mg/ml 0.5mg/ml 请问 这种情况 如何确定1抗的浓度
感激

=========================

第一个：1：1000~1：2000稀释
第二个：1：250~1：500稀释
good luck
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发表于 2013-1-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Marker中有些蛋白会显条带
我个人认为是预染M中的有些蛋白会与抗体结合
延长凝胶时间试试

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我是按照BIORAD上面推荐的分离胶和浓缩胶都是45分钟凝胶的啊 原来我们的MARKER10和17的都不是这样 好像是我用了实验室公用的TRIS和甘氨酸配胶 和这个有关不？另外一个同学也是15的胶 曝出来也是条带很宽
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发表于 2013-1-30 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个问题 我原来用的是1M的8.8和6.8 这次换成是1.5的8.8和0.5的6.8 和这个有关吗？
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发表于 2013-1-30 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：western blot 用半干转好还是用湿转好，正要买一个做转膜的仪器。蛋白质的大小20－50kD
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发表于 2013-1-30 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教两个问题：
1，跑胶时溴酚蓝下线位置表示多大分子量，蛋白会不会跑在溴酚蓝前面？
2，一抗4度过夜和室温杂交1小时甚至更长有什么区别，效果差异显著吗？
谢谢！
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发表于 2013-1-30 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：western blot 用半干转好还是用湿转好，正要买一个做转膜的仪器。蛋白质的大小20－50kD

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分子量在100K一下建议用半干
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发表于 2013-1-30 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教两个问题：
1，跑胶时溴酚蓝下线位置表示多大分子量，蛋白会不会跑在溴酚蓝前面？
2，一抗4度过夜和室温杂交1小时甚至更长有什么区别，效果差异显著吗？
谢谢！

===========================

溴酚蓝的分子量好像是8K左右
有很多小蛋白当然会跑在前面
效果的差异要看目的蛋白的丰度
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发表于 2013-1-30 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两种蛋白分子量分别为15kD、50kD，用湿转和半干转的电流和时间应如何控制
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