蛋白质与蛋白组学

版主，你好。我的待测蛋白是snail，CST公司的一抗，分子量是29kDa，跑了好几次western，这个snail蛋白就是不显示条带，好郁闷。
我是条件：下层胶是12%，上层胶是5%，溶液都是新鲜配制的。加样量为每孔20μg，蛋白样品是人肝癌细胞HepG2细胞。恒压70V跑电泳，一直跑到底，大约180min。转膜是恒流330mA，100min。用5%脱脂牛奶封闭1h，snail一抗浓度是1:500，4℃摇床过夜。荧光兔二抗浓度是1:5000，洗膜是用PBST，每次10min，洗3次。最后显影。

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我还测试一个蛋白Vimentin，也是CST公司的一抗，分子量是57kDa，同样条件下这个蛋白就有条带的。请版主指点，snail蛋白条带就是没有，这是什么原因呢？谢谢。
用BSA封闭及稀释一抗试试

请问下目的蛋白是细胞核,线粒体蛋白 ,内参可以用actin 吗?还是需要用到其他的内参. 我的目的蛋白是DJ-1蛋白 21kd.

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可以用actin

提取的是总蛋白进行检测吗/

做enos和 p-enos。用碧云天配胶试剂盒，胶浓度为说明书推荐的6%，
转膜液用一到两次，测转膜液ph值8.3，其中含0.1%sds、10%甲醇。
转膜用恒流350mA，2.5小时。
今天转膜后膜上可见marker72、95KD，marker130、170KD未见，两张膜用丽春红染色后空白。

昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两种丽春红染色空白。
请问膜空白的可能原因。谢谢！！

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是整块胶转膜的吗？

做enos和 p-enos。用碧云天配胶试剂盒，胶浓度为说明书推荐的6%，
转膜液用一到两次，测转膜液ph值8.3，其中含0.1%sds、10%甲醇。
转膜用恒流350mA，2.5小时。
今天转膜后膜上可见marker72、95KD，marker130、170KD未见，两张膜用丽春红染色后空白。

昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两种丽春红染色空白。
请问膜空白的可能原因。谢谢！！

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是整块胶转膜的吗？

不是整块胶转膜，是从电泳胶上切下包括目的蛋白的一小块胶转的膜。（昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两张丽春红染色空白。其中这四张小膜是从两块电泳胶上切下来的，一块转的膜）。谢谢！！

用BSA封闭及稀释一抗试试

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版主，我想问一下BSA跟脱脂奶粉封闭或孵一抗有什么不同吗？

提取的是总蛋白进行检测吗/   

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谢谢阿. 我提的是细胞核浆蛋白,和线粒体蛋白. actin 是也在细胞核与线粒体里面表达吗?

ERK检测完成后用stripping buffer洗去一抗与二抗
然后封闭
再用beta-actin来孵育
很好的

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最近做western发现小分子量的蛋白的第一次曝的时候还有，用一抗二抗去除液之后就曝不出来了····不知道是不是蛋白被洗掉了，用丽春红染色膜上看不到条带