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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-25 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，看了您给别人的解答获益良深，我最近遇到一个问题，就是我配的8%的胶跑出来就像是10%的胶，另外我电泳的时候，溴酚蓝经常晕开很宽的样子，而不是以前很细的一条，配胶的东西都试过了没问题。请问还可能是什么问题。急求！！！！

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检查配胶缓冲液的pH
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发表于 2013-3-25 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主您好，刚刚接触WB，请教一个比较初级的问题，上样的时候要求样品同体积，那么marker呢，是否也要同样体积？比如说我上样量40ul，marker10ul，是否还需要用PSMF补充到40ul呢，还是就用10ul。如果体积与样品不同是否会影响预染marker的条带？先谢过
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发表于 2013-3-25 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主您好，刚刚接触WB，请教一个比较初级的问题，上样的时候要求样品同体积，那么marker呢，是否也要同样体积？比如说我上样量40ul，marker10ul，是否还需要用PSMF补充到40ul呢，还是就用10ul。如果体积与样品不同是否会影响预染marker的条带？先谢过

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marker一般不用等体积上
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发表于 2013-3-25 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好！我最近在摸索CASP3这个蛋白WB的条件。不知道多大浓度的分离胶比较合适呢？我用13%和13.5%的分离胶做出来条带都是连成一条线的，电泳条件是恒流9mA,1h，这是否与浓缩胶高度有关？我们的浓缩胶1.7cm.
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发表于 2013-3-25 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好！我最近在摸索CASP3这个蛋白WB的条件。不知道多大浓度的分离胶比较合适呢？我用13%和13.5%的分离胶做出来条带都是连成一条线的，电泳条件是恒流9mA,1h，这是否与浓缩胶高度有关？我们的浓缩胶1.7cm.

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蛋白上样量多少？
应该是上样量太大的问题
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发表于 2013-3-25 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白上样量多少？
应该是上样量太大的问题

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是用阿霉素处理24h的293T细胞，上了一个15,25,35ug的梯度。有时做的beta-actin上5ug细胞蛋白都会有点连起来的样子。除了上样量的原因还可能是什么原因？
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发表于 2013-3-25 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是用阿霉素处理24h的293T细胞，上了一个15,25,35ug的梯度。有时做的beta-actin上5ug细胞蛋白都会有点连起来的样子。除了上样量的原因还可能是什么原因？

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请把样品跑一个SDS-PAGE，考染后挂上图来
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发表于 2013-3-25 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用BSA封闭及稀释一抗试试

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谢谢楼主的指点。我还有一个问题，我想做135kD大小的E-cadherin蛋白，请问上层胶下层胶的浓度，跑电泳的条件，和转膜的条件分别是什么？有什么需要注意的东西吗?
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发表于 2013-3-25 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好！我想问一下

1.内参B-actin，43kd，80V恒压转膜应该转多少时间，期间电流应该保证多大？
2.tlr3,117kd，80V恒压转膜应该转多少时间，期间电流应该保证多大？
3.两个蛋白能否一起转，时间是多少?
谢谢版主
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发表于 2013-3-25 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼主的指点。我还有一个问题，我想做135kD大小的E-cadherin蛋白，请问上层胶下层胶的浓度，跑电泳的条件，和转膜的条件分别是什么？有什么需要注意的东西吗?

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浓缩胶：5%
分离胶：10%
转膜：恒流，300mA ，2h
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