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您好，我用小鼠的脾淋巴细胞做磷酸化WB，分离细胞完成后分别刺激0,10,20,30,60min和6h，到时间后就收集细胞于冰上预冷的EP管，3000rpm/5min后弃上清，没洗涤，直接涡旋后加裂解液（已加入蛋白酶磷酸酶抑制剂，是根据园子里那个很火的磷酸化WB帖子上的配方），大约5*106个细胞加50ul。冰上作用30min，12000rpm/15min，取上清+1/4体积5*SDS-buffer，100‘C/5min，常规WB步骤，其余样本冻存-80。
因为之前普通WB已经做的比较熟练，也挺有信心，刚开始磷酸化WB，比较担心样本收集的问题。目前已经做了三四次，收集样本也重复了两次，但是都没有做出条带。我要做的是p-p38和p-JNK以及总蛋白，但是曝光出来一片空白。前两次的那批样本做的还有点高背景，p-p38出现了非常细的条带，我觉得不可用，感觉是不是样本收集时细胞量太少，于是又重新收集的样本，结果这次直接什么都没有。我提蛋白之后未定量，但是这次用的1*10 7个细胞，加150ul裂解液，作用后离心后发现管底有很大一团细胞沉淀，难道裂解的非常不充分吗？因为细胞量太大了？
之前普通WB都是用5*10 6个细胞，加50ul裂解液，没有问题的。这次怎么会一片空白什么都没有啊，非常想知道到底怎么解决。不尽感激~
