蛋白质与蛋白组学

用内参先摸索好条件

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我之前内参一直做得可以的
还要用内参摸什么条件呢

楼主，想请问下不同组织提取的蛋白做actin，大小会不一样吗？

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相同种属的大小应该是一致的
不同种属大小事不同的

您好，我用小鼠的脾淋巴细胞做磷酸化WB，分离细胞完成后分别刺激0,10,20,30,60min和6h，到时间后就收集细胞于冰上预冷的EP管，3000rpm/5min后弃上清，没洗涤，直接涡旋后加裂解液（已加入蛋白酶磷酸酶抑制剂，是根据园子里那个很火的磷酸化WB帖子上的配方），大约5*106个细胞加50ul。冰上作用30min，12000rpm/15min，取上清+1/4体积5*SDS-buffer，100‘C/5min，常规WB步骤，其余样本冻存-80。
因为之前普通WB已经做的比较熟练，也挺有信心，刚开始磷酸化WB，比较担心样本收集的问题。目前已经做了三四次，收集样本也重复了两次，但是都没有做出条带。我要做的是p-p38和p-JNK以及总蛋白，但是曝光出来一片空白。前两次的那批样本做的还有点高背景，p-p38出现了非常细的条带，我觉得不可用，感觉是不是样本收集时细胞量太少，于是又重新收集的样本，结果这次直接什么都没有。我提蛋白之后未定量，但是这次用的1*10 7个细胞，加150ul裂解液，作用后离心后发现管底有很大一团细胞沉淀，难道裂解的非常不充分吗？因为细胞量太大了？
之前普通WB都是用5*10 6个细胞，加50ul裂解液，没有问题的。这次怎么会一片空白什么都没有啊，非常想知道到底怎么解决。不尽感激~

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一抗哪里的？

老师您好，请问我用公司的浆-核蛋白提取试剂盒做核蛋白NF-kB p65表达（我做的是腹腔脏器肾脏、肾上腺等器官），
1）文献中有的用的是actin做内参不正确吧？那么应该用lamin还是Histone呢？
2）lamin有A/B/C，Histone也有H1/2/3/4。那么，我该怎么选择呢？
急盼回复，十分感谢！

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你说的lamin B，histone都可以作为核内参

actin也有做核内参的文献

suiyuanjiuzhu wrote:
我之前内参一直做得可以的
还要用内参摸什么条件呢

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稳定WB系统

最近做perk，总是做不出来，或者背景深条带浅，但是总蛋白做的很好，有些疑问：
1、蛋白裂解后要马上变性吗？我因为BCA法测总蛋白，配平总蛋白需要时间，不能马上变性。
2、变性后不要室温冷却而是直接放冰箱吗？我们实验室好像都是室温冷却再放-20.
3、封闭用10%的脱脂牛奶有问题吗？网上都说用5%的
4、二抗用5%牛奶稀释，还是5%BSA,还是TBST?
5‘条带不明显是抗体（CST）原因还是蛋白不够多呀（加样总蛋白估计有60ug）？
急求楼主回答，我现在做了不下七次了，劳心劳力，很纠结。

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封闭、稀释一抗用3%BSA-TBST
二抗5%奶粉-TBST

perk做起来如同marker一样好做

楼主，为何我最近做的指标条带都出现在55KD以下一点的地方，特异性强，不同的指标位置是一样的，如果认为是目的条带的话就和指标大小差多啦。这是什么原因呢？

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样品来源是什么？
一抗货号，公司
二抗货号，公司