蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  479/610 |‹‹‹477478479480481482483484485486›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
4781

发表于 2013-3-26 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2013-3-26 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
actin有两条带？

========================================

下面是两种膜做actin的图片，actin大小是42KD

PVDF膜这张
调整一抗稀释度
用的都是相同样品啊？
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
4782

发表于 2013-3-26 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PVDF膜这张
调整一抗稀释度
用的都是相同样品啊？

=========================================================

是大部分样品相同，都来自人肾脏。PVDF膜您觉得哪个带是目的条带？
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
4783

发表于 2013-3-26 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我感觉pvDF膜这张背景还好啊，和Nc膜这张一抗浓度都是一样，为什么需要调整浓度呢？之前我不是问过为什么我做不同指标时候为什么带都在55K偏下一点的地方么，我想是不是这个原因才导致PVDF膜有两条带，其中稍大的是非特异性条带，稍小的细一些的才是目的条带。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
4784

发表于 2013-3-26 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我感觉pvDF膜这张背景还好啊，和Nc膜这张一抗浓度都是一样，为什么需要调整浓度呢？之前我不是问过为什么我做不同指标时候为什么带都在55K偏下一点的地方么，我想是不是这个原因才导致PVDF膜有两条带，其中稍大的是非特异性条带，稍小的细一些的才是目的条带。
非常奇怪，有意思
这个实验重复过吗？

==================================================================

从原理上来说：只能是不同的两种膜对抗体（也是一种蛋白哈）的非特异吸附不同
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
4785

发表于 2013-3-26 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师你好，我现在做gapdh和bcl-2，因为听我们这儿实验室有人做过的，所以用的bio-rad的80mA湿转40分钟，转完之后胶上和膜上基本都看不到marker，胶染色之后发现还残留有蛋白，今天显影时只发现gapdh显影了，bcl-2的胶片一点都没显影，检查了一下电极应该没错，短路的可能性也不大，电转液也是新配的，想咨询一下哪里可能出问题了。
顶部
PCR[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74238
精华 0
积分 414
帖子 448
信誉分 100
可用分 3201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
4786

发表于 2013-3-26 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好 我才做wb实验 很多都不大明白 这次做了一次 发现洗出片子上什么也没有 连marker 都没有。pvdf 膜上都还有的。分析原因 怀疑是pbs里的磷酸二氢钠 称错了 试剂有结晶水 我按没结晶水称的 但ph调到的就是7.4 请问老师 是不是pbs的问题
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
4787

发表于 2013-3-26 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求教抗体交叉反应的问题。
现要检测某一植物蛋白，没有现成的的抗体，请问用其同源人类蛋白的多抗可不可以，成功的可能性有多大？
谢谢回复。
by the way. Genescript 的抗体怎么样？有谁用过吗？
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
4788

发表于 2013-3-26 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师请教一下，western做actin总是有问题。目的条带17k，actin43k，上样30ug，用15％的胶，100v两小时，后湿转膜100mA，90分钟，一抗1:1000，二抗1:5000，出现的actin哑铃状且细。希望能指点一下。


查看积分策略说明
附件
2013-3-26 11:00
82963987.snap.jpg (47.86 KB)
 
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
4789

发表于 2013-3-26 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二抗说明书

===============================================================================

这个二抗不行
应该用这种
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Hu, Ms, Rat Sr Prot)，HRP标记（Jackson、Abcam等都有卖的）
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
4790

发表于 2013-3-26 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好，我现在做gapdh和bcl-2，因为听我们这儿实验室有人做过的，所以用的bio-rad的80mA湿转40分钟，转完之后胶上和膜上基本都看不到marker，胶染色之后发现还残留有蛋白，今天显影时只发现gapdh显影了，bcl-2的胶片一点都没显影，检查了一下电极应该没错，短路的可能性也不大，电转液也是新配的，想咨询一下哪里可能出问题了。

=================================

残留蛋白是在大分子量还是小分子量？
顶部
 6097  479/610 |‹‹‹477478479480481482483484485486›››|