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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-26 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好 我才做wb实验 很多都不大明白 这次做了一次 发现洗出片子上什么也没有 连marker 都没有。pvdf 膜上都还有的。分析原因 怀疑是pbs里的磷酸二氢钠 称错了 试剂有结晶水 我按没结晶水称的 但ph调到的就是7.4 请问老师 是不是pbs的问题

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pH最关键
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发表于 2013-3-26 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求教抗体交叉反应的问题。
现要检测某一植物蛋白，没有现成的的抗体，请问用其同源人类蛋白的多抗可不可以，成功的可能性有多大？
谢谢回复。
by the way. Genescript 的抗体怎么样？有谁用过吗？

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1、用免疫原进行抗体检测
2、用阳性样品
3、没有现成的抗体可以自己制备。
4、Genescript抗体不太了解，没用过
这个公司有你的抗体？
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发表于 2013-3-26 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师请教一下，western做actin总是有问题。目的条带17k，actin43k，上样30ug，用15％的胶，100v两小时，后湿转膜100mA，90分钟，一抗1:1000，二抗1:5000，出现的actin哑铃状且细。希望能指点一下。

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这是电泳的问题
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发表于 2013-3-26 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
残留蛋白是在大分子量还是小分子量？

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gapdh和bcl-2两者都有残留，但是gapdh最终显影有影像，bcl-2没有影像，可能是转膜时间不对吗？
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发表于 2013-3-26 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近转膜后膜上的预染marker只有72KD 55KD两条带清楚，其他带都很淡，用考马斯亮蓝染胶，胶上没有条带。转膜条件是350mA 1h.这是什么原因呢？
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发表于 2013-3-26 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主您好！我最近做western blot 遇到了一个问题。用的是BIO-RED的电泳仪。加完样，开始跑胶大概十分钟后，会有一个甬道的样本漏入浓缩胶和分离胶之间。这样就导致这个孔的内参与别的孔不一致，而且会影响别的样本的最终结果。最近一直出现这个问题。我想请教一下，这可能是什么问题引起的？
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发表于 2013-3-26 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！
哈还有就是1*电泳液要配多少合适呢，以前六一的500ml足够了，但我看了这个电泳槽挺大的。还有电转液大致配多少合适，谢谢您的指导！感激不尽！
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发表于 2013-3-26 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈不好意思，是十个梳孔的那种
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发表于 2013-3-26 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！
哈还有就是1*电泳液要配多少合适呢，以前六一的500ml足够了，但我看了这个电泳槽挺大的。还有电转液大致配多少合适，谢谢您的指导！感激不尽！

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分离胶大约3.5ml，浓缩胶1ml多点就可以了。
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 小中大
分离胶大约3.5ml，浓缩胶1ml多点就可以了。

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哈谢谢你的解答，我们应该用的不是同一种的电泳槽吧
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