小中大请问，多次重复western blot如下步骤，除了内参，其余指标均无任何成像，漆黑一片。请问到底哪里出问题了？急需大家帮助，谢谢！我做的是SD大鼠脑组织
1）12%+5%的sds-page胶，组织上样50ug。
2）电泳60V至彩虹maker条带初步分离，改100V至样本跑至底部。
2）转膜：采用湿转。70KD以下小分子量蛋白转膜58分钟，70KD以上大分子量蛋白转膜88分钟。转膜中散热良好。转膜后用考马斯亮蓝染page胶，仅剩少量蛋白。
3）封闭：用碧云天封闭液室温摇床封闭2.5-3小时。
4）一抗孵育（没有剪PVDF膜）：所有抗体均为cell signaling technology公司进口原装产品，用碧云天一抗稀释液或者脱脂奶粉1:500—1:1000稀释一抗（NF-KB、IKB、p-IKB、TLR4，抗兔），4℃摇床孵育过夜（约12h）。
5）洗涤：TBST洗涤三次，时间均为10分钟。
6）二抗：BioRad公司进口原装，二抗室温孵育50分钟。
7）洗涤：TBST洗涤三次，时间分别为10分钟、10分钟、15分钟。
8）成像：碧云天显影液A+B显影，强曝12分钟。
9）结果：4个指标均无任何条带显示。
10) 用丽春红染料染pvdf膜，无论大分子还是小分子蛋白，膜上条带清晰。
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1、弃用碧云天的一抗稀释液，自己配制封闭及一抗稀释液
2、TBST是你自己配制的还是买现成的？
3、把你的内参图放上来看看
