蛋白质与蛋白组学

但是我前面跑过几个western，还马马虎虎，就是觉得band很淡，朦朦胧胧的，是不是跟加水有关，附图是跑caspase3的，一抗1:3000, 感觉条带有点散，中间有个band好像弯了，请帮忙诊断一下，谢谢！

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肯定会有影响

Western blotting新手，想请教楼主：
准备做人肝癌细胞和人肝癌组织HBx(乙肝病毒X蛋白)的表达，分子量17kd，
1.抗体不知买哪家的好，查了很多文献，多数使用abcam和chemicon的，看了下abcam的抗体，比较贵，有ab39716\ab2741\ab235，似乎能够既做免疫组化又WB的只有ab39716,可是只有50ug，不知是否够用呢？ab39716在cross ractivity 写到React with Hepatitis B Virus,不知是什么意思，而另外两个ab235和ab2741都没有写。另外好像ab235公司推荐是做免疫组化，但是网页上的文献也有做了WB的，不知是什么原因，我问了别人似乎说ab2741也可以，因为推荐用途IP,别人似乎说做免疫沉淀的也可以做免疫组化，不知到这种说法是否正确。
chemicon的抗体MAB8419 用于ELISA, WB, IC（Immunocytochemistry）是否是指用于免疫组化，cuturl('http://www.millipore.com/catalogue/item/mab8419abcam')的抗体
ab39716
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-ab39716.htmlab235')
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-3F6-G10-ab235.htmlab2741')
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-X36C-ab2741.html')因为实验时间比较紧张，所以很着急，真的不知该选哪个抗体好，还请高手指教
2.HBx是用半干转还是湿转法好，准备用0.22um的PVDF膜
谢谢！

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正在做这个蛋白，用了一个是abcam的抗体，没有检测到
现在正在做转染后的检测
下周能出结果

请教两个问题
1. 一抗和二抗都用多克隆抗体，有影响吗
2. 对于所用的一抗，其效价和灵敏度有要求吗，这个希望详细点解释，谢谢

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1、没有影响
2、效价和灵敏度要求？？？？

我最近几次做胶，发现样品进入分离胶后在最前方出现0.5CM的油状区域，会滞留一部分蛋白，是哪里出问题了啊？？

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这种情况基本正常

楼主你好，有几个问题想请教一下：
1、提细胞核内的蛋白用PIRA强裂解液+PMSF可以吗，还是一定要用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒？
2、磷酸化蛋白一抗用BSA+1XTBST稀释比5%脱脂牛奶好对吗？这里的BSA是指(BSA) Fraction V 吗？
3、知道做P-JNK有什么注意事项或是经验总结吗，做了一个月了还没有结果，急啊！
谢谢！

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用什么裂解液？
哪个公司的？

转膜后，膜染色了吗？

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版主，你好。我最近提取SD大鼠的大脑皮质层做WB，突然出现了白板。
以下是我的实验条件：
上样量30ug/cm，目的蛋白55kd
（一）电泳
浓缩胶60V，分离胶120V,
（二）转膜
100V恒压1.5h
（三）封闭
5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉加入100ml0.1%TBST中）常温封闭2h
(四)孵抗体
一抗4℃过夜（Abcam,1:1000）,洗膜，15min,4次（由于我预实验跑出来的背景较深）
二抗常温1.5h(1:15000 jackson),洗膜，15min,4次。
（五）发光
发光液用的是thermo 的supersignal west pico,pico可以跑出很清晰的条带，用west dura时会出现很脏的背景。
最近几次跑WB,都是白板，后来又继续跑了两次，把电泳液，转膜液，TBST都重新配置，把胶转膜前和转膜都做了考染，发现转膜和蛋白样品都不存在问题，于是又换了一款灵敏度高的发光液dura，刚孵上的前十几秒可以肉眼都可以看到目的蛋白和内参的英冠，但很快就淬灭了，估计前几次白板可能是淬灭的原因。前几天重新做了一次，跑了两张膜，因担心PVDF膜有问题，到旁边实验室借了一张膜，另一张膜用实验室的，结果两张膜都出了结果，只是借来的膜荧光大概持续约半小时就淬灭了，实验室的膜大概10分钟就淬灭了。今天又重新跑胶，但是又开始出现白板，这次直接连荧光都没看到。这是后来将膜用丽春红染色的图片。看不到什么明显的蛋白，难道是转膜过度吗？或者还PVDF膜的原因？