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标题:【讨论帖】western blot问题解答

loli[使用道具]
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发表于 2013-3-26 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，我取的PC12细胞总蛋白，我的目的蛋白是Nrf2,HO-1,不知上样多少蛋白合适。蛋白太多会导致不出结果吗。
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-3-26 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、弃用碧云天的一抗稀释液，自己配制封闭及一抗稀释液
2、TBST是你自己配制的还是买现成的？
3、把你的内参图放上来看看

=======================================================

会不会是一抗问题？tbst也是自己配的。重复近10次了，还是啥都没有。
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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-3-26 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，您好
今天我们跑得胶怎么有几个孔成水滴状呢，这次我们上样的体积是37.5ug，然后所有的样本都用1xbuffer补足到了相同的体积。
会不会出现这种可能，上样体积小的那个孔，由于加的补足的loading buffer 的体积要大很多，然后比重就要大，在跑的过程中，速度较慢。因为，我看了一下，那两个成水滴状的孔，刚好就是我补足的loading buffer 体积最小的那个孔。
还有，今天我的片子曝光成空泡状，是不是因为底物信号太强，速度消耗底物造成的空泡状呢。
期待您的回复，谢谢
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发表于 2013-3-26 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参和阳性对照都出来了，蛋白是自己构建的HIV-1AE亚型V4环382/388之间的短肽，l裸肽段是11kD，经糖基化修饰后达到了40kD。
自己制备的抗体就不好说了

===============================

是不是这个蛋白在样品中没有表达？
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发表于 2013-3-26 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，我取的PC12细胞总蛋白，我的目的蛋白是Nrf2,HO-1,不知上样多少蛋白合适。蛋白太多会导致不出结果吗。

==============================

我们做细胞样品上样量是10-15ug
组织样品是20-40ug
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发表于 2013-3-26 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
会不会是一抗问题？tbst也是自己配的。重复近10次了，还是啥都没有。

================================

这个完全有可能

另外现在国内做WB的试剂参差不齐
问题很大
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发表于 2013-3-26 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好
今天我们跑得胶怎么有几个孔成水滴状呢，这次我们上样的体积是37.5ug，然后所有的样本都用1xbuffer补足到了相同的体积。
会不会出现这种可能，上样体积小的那个孔，由于加的补足的loading buffer 的体积要大很多，然后比重就要大，在跑的过程中，速度较慢。因为，我看了一下，那两个成水滴状的孔，刚好就是我补足的loading buffer 体积最小的那个孔。
还有，今天我的片子曝光成空泡状，是不是因为底物信号太强，速度消耗底物造成的空泡状呢。
期待您的回复，谢谢

================================

1、上样体积可能太大了
2、上样体积是多少？
3、二抗浓度太高会造成这样的空泡状
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主好，我提得是组织蛋白，测浓度蛮高的大概在10ug/ul，每孔上样是30ng
内结果内参条带很好，但是目的很模糊，糊糊的。怎么样才能清楚呢？
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发表于 2013-3-26 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主好，想请教一个问题，最近做western 跑胶，转膜后分别孵内参和目的蛋白的抗体，显影时内参条带很清晰，但目的蛋白条带总是出不来，试着调整抗体浓度，一抗用的是santa cruz 以1:500稀释时，显影时全片发亮，以1:1000稀释时，无任何条带。二抗用的是进口分装的，跟内参用的是一个品牌，均以1:4000比例稀释。请问是否是因为抗体浓度不合适，该如何调整，还是因为别的原因。谢谢！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


老师：我这是内参GAPD曝光后的图片，图片中有的条带出的很不均匀，有的出的蛮好的，膜都重新孵育一抗、二抗两次了，条带还是出的不完整，不知道是什么原因造成的，该怎么改进？
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