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标题:【讨论帖】western blot问题解答

loli[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问版主，您的做的HBx蛋白出结果了吗？
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发表于 2013-3-26 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主好，想请教一个问题，最近做western 跑胶，转膜后分别孵内参和目的蛋白的抗体，显影时内参条带很清晰，但目的蛋白条带总是出不来，试着调整抗体浓度，一抗用的是santa cruz 以1:500稀释时，显影时全片发亮，以1:1000稀释时，无任何条带。二抗用的是进口分装的，跟内参用的是一个品牌，均以1:4000比例稀释。请问是否是因为抗体浓度不合适，该如何调整，还是因为别的原因。谢谢！

================================

1、一抗本身特异性等不太好
2、二抗稀释度试试1:10000,1:20000
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发表于 2013-3-26 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师：我这是内参GAPD曝光后的图片，图片中有的条带出的很不均匀，有的出的蛮好的，膜都重新孵育一抗、二抗两次了，条带还是出的不完整，不知道是什么原因造成的，该怎么改进？

===============================

1、上样孔不齐
2、上样的体积太大，电泳时压不齐
3、转膜后请用丽春红染色检查
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发表于 2013-3-26 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问版主，您的做的HBx蛋白出结果了吗？

=============================

不好意思啊
转染后的样品依旧没有检测到HBx
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kswl870[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主好，我提得是组织蛋白，测浓度蛮高的大概在10ug/ul，每孔上样是30ng
内结果内参条带很好，但是目的很模糊，糊糊的。怎么样才能清楚呢？
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发表于 2013-3-26 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，你好！
我用的NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒提取的鼠肝脏组织核内蛋白PPAR，分子量52kda,一抗买的abcam公司，内参LaminＢ１及二抗用的novus公司，Pierce® BCA Protein Assay Kit蛋白定量，上样量40微升总计20微克的蛋白，积层胶60V40min，分离胶110v,120minn，300mA恒流PVDF转膜1小时，均用5%的脱脂奶粉TBST室温1小时封闭，一抗均以1:1000及1:2000 二个梯度5%的脱脂奶粉TBST 稀释，4℃摇匀过夜，TBST3×10分钟洗涤，二抗均以1:2000的5%的脱脂奶粉TBST 稀释，室温摇床孵浴1小时，TBST3×10分钟洗涤，PierceECL显色液，经曝光后，内参的两个稀释度均可见条带，但目标蛋白的两个稀释度曝光10分钟仍无任何信号，第一次做weston，不知道什么原因，还望楼主帮忙分析，谢谢！
我从abcam公司网站上发现已有人用该抗体从大鼠及小鼠肝内、脂肪等相关组织及细胞均试验成功，但他们有用脱脂奶粉封闭，有用BSA封闭的，抗体稀释有的用TBST，有的用PBS-吐温，版主你好，你觉得是这方面的问题吗？急盼你的解答，谢谢！
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，你好，我western跑的目标蛋白是170KD的核蛋白，我想请教以下几个问题:
1.用pierce的M-PER全蛋白裂解液提取核蛋白可行嘛，比提胞浆蛋白是否需要时间长一点，之前用这个提，目标蛋白的条带一直都比较弱，药物刺激后目标蛋白的泛素化条带一直跑不出来
2.转膜液中需要加SDS嘛，之前一直在用300mA 1h转膜貌似效果不是很好，我们实验室用的电泳仪是六一的，楼主能不能推荐一个方案
3.电泳液跟转膜液中的甘氨酸、tris碱含量是相同的吗？
急盼版主的解答，谢谢
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kswl870[使用道具]
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 小中大

SDS分离胶与浓缩胶储存液PH值分别是多少？配胶时要调吗？
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pengke1983[使用道具]
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 小中大
你好，我的目的蛋白139KD，请问转膜时，湿转需要多大的电压？多长时间呢？谢谢
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助楼主，今天跑western，一块12%，一块7.5%，电泳结束marker条带很清晰，但是转膜后全部条带变成很模糊的，转膜液新配，-20度预冷3小时，恒压400mA， 1个小时，转膜结束后就成这样了，转膜液应该没有问题，请问还有什么其他可能，谢谢！


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