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标题:【讨论帖】western blot问题解答

minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗进口还是所谓国产（or 国内分装）？
内参选择beta-actin，GAPDH等都可以

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恩，一抗用的是进口分装的，内参用的actin，谢谢楼主~~以为我的问题不会被回答了呢，以后有问题还得像楼主请教
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am10[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天染了actin，发现两边的band都smear了，淡中间的还好，突然想起一个细节，昨天为了降低转膜液的温度，放到-20度冻了3小时以后再转膜，今天不去冻就好了，不知道是不是这个问题？


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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想问版主，是不是有的抗体可以做出western,但是做不出荧光啊？
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好！
我最近开始跑WB，分子量106kd，用了8%的分离胶，转膜用湿转恒压100v2个小时，5%的脱脂奶粉RT封膜1小时候RT孵育一抗1小时，用的是santa的，试了1:100,1:200稀释度，二抗1:5000,RT孵育1小时，显影后发现背景很深，而且杂带非常多，目标条带处未见明显的条带出现，现在上样量已经上到90ug了，这是怎么回事啊？下一步做的话应该从哪里着手更改条件？
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人我新手，请问楼主我想做心肌的eNOS和p-eNOS，请问您觉得那家公司的抗体比较好，还有园子里说转膜特难，给个建议的条件吧！谢谢！
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

请大家在我的信息里查看QQ号与邮箱等联系方式
可以在线解答

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你好！我最近一批WB时几乎都是actin能出条带，但是目的蛋白从来都是干干净净，一丝条带也没有。转完的膜上可以看到marker，蛋白应该也有转上去吧。一抗4度过夜，然后TBS-T洗三次，每次10分钟；二抗37度孵育一小时，TBS-T洗六次，每次5分钟。然后ECL发光。为什么同样的过程actin可以但是目的蛋白没有呢？
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发表于 2013-3-26 14:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

==============================================================

f你好，我刚做WB，做二抗的稀释度是直接用稀释的二抗点在新的NC膜是吗？
还有上边所说的RT干燥是什么意思？谢谢！
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发表于 2013-3-26 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好！我的目的蛋白有200KD左右 请问一下跑胶的条件是什么？还有应该选择多大浓度的分离胶啊？还有转膜的条件？？没做过这么大的蛋白，还请指教，谢谢
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主您好
我在设计重组质粒pcDNA3.1-myc-his(B)-目的基因 转染HEK293T细胞后用western blot检测表达量的实验，可是不知道如何设立阳性和阴性对照。一抗是c-myc单抗。
我这样想：阳性对照是转染空载体pcDNA3.1-myc-his(B)的细胞，阴性对照是不转染质粒的细胞。请问对吗？
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婴儿脸[使用道具]
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发表于 2013-3-26 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！我最近一批WB时几乎都是actin能出条带，但是目的蛋白从来都是干干净净，一丝条带也没有。转完的膜上可以看到marker，蛋白应该也有转上去吧。一抗4度过夜，然后TBS-T洗三次，每次10分钟；二抗37度孵育一小时，TBS-T洗六次，每次5分钟。然后ECL发光。为什么同样的过程actin可以但是目的蛋白没有呢？
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