蛋白质与蛋白组学

如果条带特异的话就认为它就是目的条带
目的蛋白有时候位置有些变化不会影响结果

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谢谢您的回复。
条带是特异的，但是跟分子量差别也太大了，我看过santa提供该抗体的WB图谱，条带在90KD，跟我做的不一样。
另，请教，我10％的胶，100V电泳4小时，50mA半干转膜2小时，这个条件对我这90KD的蛋白合适么？

谢谢

我的PVDF膜丽春红染色有蛋白，而所有的目的蛋白和内参都作不出来，以前都能做的出来，我也考察了溶解抗体的含5％脱脂奶粉的TBST,二抗也重新换过，内参也重新换过，但是还是做不出来，请问还可能哪个环节出问题，谢谢您帮我出出主意，！
我的条件是：
1.目的蛋白68KDa,59KDa,用10％分离胶，5％浓缩胶。分别80V,110V电泳。
2.60V，120min湿转。转膜完毕丽春红染色可见PVDF膜有明显的蛋白条带
3. 5％ TBST配置脱脂奶粉封闭1h,5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗，4度过夜，TBST洗两次，TTBS洗一次，每次10min,上相关二抗1h，洗膜同上，ECL显色。读片。

在这个过程中以前都这么做的，都能做得出，就是这次换转移缓冲液，但蛋白也转到膜上了，换了几个抗体及内参都没作出来，不知道问题出在哪里。
十分感谢您的指导！

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一抗多长时间了
一抗可能过期了吧

你好！我做WB开始电泳转膜都很好，上样总蛋白40ug/10ul，考马斯亮兰条带清晰，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗三种4度过夜：1/actin 1:1000，2/santa 的一抗1:1000，3/血清1:250，二抗1:5000常温1h，ECL显色后发现背景高，X光片上目的条带出现空洞，在膜上目的条带位置依稀可辩黄色条带。第二次做采用封闭过夜，一抗常温3h，二抗浓度增大为1:20000常温1h，显色后发现actin的背景降低了，条带清晰，但另外两个一抗的背景仍很高，目的条带处仍出现空洞，请问我下一步该怎样调整实验条件呢？是一抗过高么？谢谢！

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减少上样量

天气高温对电泳在分离胶弥散有没有影响？

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电泳时温度高会影响条带
但是室温不会高的那个程度吧

想请教下老师，我做的分子量是38、42、55KD的，我应该用百分之多少的分离胶啊？用10%的对结果影响大吗？另外在做的过程中，我遇到了以下一些问题想请您帮助下。首先，我蛋白跑完电泳后，做了考马氏染色，蛋白条带很清楚，于是第二天接着用这批蛋白样品做western（蛋白负20保存）。转膜条件我用的是200ma60分钟，电转仪是BIORAD的。转完后，我把膜用丽春红染色，什么都没有。转完膜的胶我考马氏染色后发现还有很多蛋白条带，我考虑是否是我时间短了，于是第二次转了100分钟，膜用丽春红染色还是什么都没有看到，转完的胶条做考马氏染色，发现仍有一根非常清楚的蛋白条带。第三次，我用了0.22的膜转75分钟，立春红染色还是什么都没有！我觉得非常疑惑，不知该怎么调整！同实验室的做42的分子量，200ma45分钟，膜经立春红染色后条带都很清楚，可是我之前也试过45分钟，胶上的marker都超清楚。这究竟是怎么回事啊？请您帮我分析下吧！电转液我也是新配的啊！

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1，用12%或者15%的胶
2，检查你转移的时候电流是否通好
3，电转液可能有问题
建议问你同学