蛋白质与蛋白组学

问题是，我上图是1:10000的二抗，下图前四个也是1:10000的二抗，后四个是1:20000的二抗，但是背景差异都很大，而且下图始终无法达到上图的效果

其次，为何再也得不到如上图般又粗又黑成椭圆状的条带了？

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缓冲液有所改变？
二抗孵育体系多大？
是否因为您的体系太小而影响了稀释度

我做的蛋白通常都是10mg/ml左右，要是BSA线性范围这么低的话，我该咋办，换成别的什么做标准曲线呢？上次我做动物蛋白，裂解液和动物组织比例没做好，测出来的最低浓度是2点多，被老板批评了。。。她说通常要10mg/ml。

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你老板批评是有一定道理的
动物组织一般裂解出来是在10-20mg/ml
进行BCA定量的时候
样品用PBS进行10倍稀释不久在BCA的线性范围了？？？

今天做的western ECL发光，内参的图很好，而目的基因曝光1分钟时什么也没有，延长曝光时间至5分钟，可看到模糊的条带，感觉条带宽度可以，就只整体上模模糊糊，只能看到轮廓。 目的基因一抗是santa的，4度保存，分装后已近两年，按1:100稀释的；内参b-actin，按1:1000稀释，二抗是按1:4500稀释的。求帮忙分析一下是什么原因导致这样的结果，是一抗时间太长吗？？

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用什么公司的ECL？
货号多少？

谢谢你的答复，我又重复了两次，图片如下，是什么原因呢，我真的无从分析，怎么办才能找出我的错误之处呢，因为一直重复都是一样的趋势啊，再次表示感谢
??

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40ug的时候条带不是还不错吗？
另外降低一抗的浓度，加大一抗稀释度试试

请教一下：做WB一段时间了，但好看的结果一直没有。请指教。
目的蛋白：91kd，内参actin 43kd。用碧云天RIPA（强）裂解液提取细胞总蛋白，加入上样缓冲液变性，保存。
10%分离胶，5%堆积胶。上样量10ul，75v30分钟，90v60分钟，此时溴酚蓝已到达胶的底部。转膜用0.45umpvdf膜，条件
：100v，120分钟（目的），60分钟（actin).丽春红染膜，见蛋白条带为淡淡的红色，此时胶上的marker条带全部被转移。5%脱脂奶粉的PBST溶液室温封闭1小时；PBST洗膜，5min*2次；一抗目的（1:300），内参（1；5000）孵育，4度过夜+室温分钟；PBST洗膜，5min*3次：二抗HRP标记，（1:5000），孵育，室温1小时；PBST洗膜，5min*3次；ECL曝光。
结果目的有条带出来，而内参竟不出条带。重复多次仍一样结果，重显等法仍不能出现条带。
疑惑不已。

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1、操作没有问题
2、所有试剂的质量需要考虑

上贴 忘了说明：我是湿转的。bio-rad的仪器。
还有一个问题，蛋白不会转过吧？我看到靠膜滤纸有marker条带显示的。但有人说不会转过的。
还有说法：说两边滤纸不要接触，会造成短路，疑惑；切后的胶及用来转的膜没有滤纸大啊，两边滤纸肯定要接触的啊。

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湿转没关系的，不会短路