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标题:【讨论帖】western blot问题解答

pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-3-28 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近实验我有个问题，其一是所有膜的背景很深。我想问会不会和TBST有关系，TBST的PH7.4 关系会有很大吗？
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发表于 2013-3-28 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近实验我有个问题，其一是所有膜的背景很深。我想问会不会和TBST有关系，TBST的PH7.4 关系会有很大吗？

==================

膜的孔径是多少？
二抗稀释度调整过吗？
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彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2013-3-28 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
缓冲液有所改变？
二抗孵育体系多大？
是否因为您的体系太小而影响了稀释度

============================================================================================================

谢谢您的回复。
缓冲液一直是碧云天的二抗稀释液
所谓的孵育体系是指？稀释度是1:10000，但是重复性很差，同样情况（包括时间和稀释度）下两次出现的背景都相当不同。如果是指容量，我用的是一个塑封袋，根据膜的大小用枪头注入适当的稀释二抗进行孵育。
体系太小影响稀释度是指？
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发表于 2013-3-28 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用什么公司的ECL？
货号多少？

=============================================================================================================

谢谢你的回复，发光液的牌子和货号我没太注意，但肯定是实验室常见的，我看到同实验室的其他人也用这个牌子的。。而且，我用这个发光液发的内参图很好，所以我想应该不是发光液的原因吧。
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发表于 2013-3-28 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外还想问一下，跑出的内参图条带宽窄不一是不是一定是因为上样量不一样？
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发表于 2013-3-28 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你老板批评是有一定道理的
动物组织一般裂解出来是在10-20mg/ml
进行BCA定量的时候
样品用PBS进行10倍稀释不久在BCA的线性范围了？？？
多谢老师回复!

===============================================================================================================

今天我又做了一批蛋白，平均浓度时6——8mg/ml的样子，今天做的标准曲线R方是0.9826 还差那么一大截！
开始我说的是用BSA配制溶液做标准曲线，可是老师说的是BCA定量，我查BCA他是个试剂盒，不知老师说的BSA线性范围是我的BSA的线性范围吗？
老师真智慧，我咋没想到用稀释呢...
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发表于 2013-3-28 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你老板批评是有一定道理的
动物组织一般裂解出来是在10-20mg/ml
进行BCA定量的时候
样品用PBS进行10倍稀释不久在BCA的线性范围了？？？

==============================================================================================================

还有个问题想请教，细胞的通常都是2-5mg/ml的样子，为什么动物组织通常都要做到10-20mg/ml呢？差别这么大，我想大的浓度早晚也要调低的呀，如果把动物的组织按细胞的2-5mg/ml，会有什么不良后果吗？究竟是什么道理呢？因为有时候会有些动物标本组织块比较小，比较珍贵，能不能这么做呢？
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发表于 2013-3-28 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、操作没有问题
2、所有试剂的质量需要考虑

==========================================================================================================

谢谢老师。
我目的蛋白可出来条带，说明系统还可以。应该主要是内参抗体出问题啦。我再稀释内参抗体看一下。
为省点膜，我把胶切开，目的蛋白部分和内参部分分别转吧。请问一下，目的91kd，内参43kd，湿转的话，最好的转膜条件应该是怎样的？
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发表于 2013-3-28 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢您的回复。
缓冲液一直是碧云天的二抗稀释液

===============================================================================================================

所谓的孵育体系是指？稀释度是1:10000，但是重复性很差，同样情况（包括时间和稀释度）下两次出现的背景都相当不同。如果是指容量，我用的是一个塑封袋，根据膜的大小用枪头注入适当的稀释二抗进行孵育。
体系太小影响稀释度是指？
一抗、二抗重复回收使用？
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NBA[使用道具]
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 小中大
另外还想问一下，跑出的内参图条带宽窄不一是不是一定是因为上样量不一样？

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1、上样量总蛋白、上样体积不一致
2、梳孔大小不同
3、转膜的影响
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