蛋白质与蛋白组学

刚刚开始做western，电泳的每个样品条带总是呈现“U”型，重新配置了电泳液，丙烯酰胺，配胶的时候也挺注意的，但是每次加完样后，胶柱两边就会有残留，跑成这个样子。希望高人能帮我解答，无比感激！！！

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这个不是胶的问题
我觉得是loading buffer

终于看到高手啦 希望帮我解决几个问题呗？？ 1.我的内参都稳定的出，就说明我的样没错吧? 但是目的蛋白出的就是没有趋势，要不就不出？？ 请帮我总结下都会有什么原因吗？？ 因为急于想要结果 2.如果是因为样的原因？是不就得重做动物实验啊？？ 我是用脑缺血模型取脑组织 请帮帮我吧

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动物实验一般不会有显著性的趋势

楼主你好！
我们用fermentas的maker。10-250kda的那种。湿转。
用SDS-PAGE胶10%，80V大概要2h10min跑好胶。maker分离良好。
用PVDF膜045um的转，使用前用100%甲醇浸润1min。
转膜缓冲液用tris-base30.3 glycine 144.0 20%/v甲醇ddH2O 1L
用80V 、60V转膜2h，发觉36、28、17、10kda的条带转膜很淡，基本看不到。大分子的还好。

然后昨天用新配TB，跑完胶上架后发现TB不够，用了大概20min配TB，期间膜有一半泡在TB里，然后用80V2h转膜，结果发现36、28、17、10kda都转得好漂亮，但是以上的50 70kda的转了一半，分子量再大的就没转上。
之后重夹补甲醇浸润，再80V追加半小时。结果一样。

之后重跑，用新的用过两次的TB转，结果跟之前的一样36、28、17、10kda的条带转膜很淡，基本看不到。大分子的还好。

湿转的话温度控制在多少最佳？
磁转子搅拌加外置碎冰控温，水槽上下温度均衡维持在8C。
磁转子搅拌加外置碎冰控温加内置冰袋，水槽上下温度均衡维持在4C。

转膜滤纸可以重复使用吗？

PVDF膜需要比滤纸大么。即使是比滤纸大，marker一样转得不清晰。

求教，转膜的电压/电流，时间，转膜缓冲液，转膜缓冲液的温度。

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1、湿转 不需要控制温度，只是电压与电流不要太高就行
2、滤纸可以重复使用

老师您好，有两个问题需要咨询：
（1）两张NC膜，转膜后，一张上面是大鼠腓肠肌蛋白样，另一张是大鼠比目鱼肌蛋白样，进行封闭时，两张膜是否可以一起封闭？
（2）进行小分子量指标的wb测试，分子量为15-20kD，我们实验室是半干转，20V，请问，转膜时间设定为多少较为理想？我试过40、50、60min，都有条带出现，但是我不知道，是不是转膜完全了，我想知道一般情况下这种分子量的蛋白半干转转膜时间是多少？

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1、为什么要一起封闭呢？
当然也可以一起封闭，不过建议分开进行
2、半干我用过1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，15-20K的蛋白转膜20min，0.22um孔径膜

请问楼主，western blot能检测出至少什么质量级别的蛋白，是多少毫克急别还是多少微克？ELISA呢？

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WB可以检测到fg级别
ELISA我不太清楚

请问，若目的蛋白的浓度差异在1-4倍左右，能否直观观察到条带之间的差异呢？用的是thermo的ECL显色液，化学发光仪拍照。目前重复的结果是看不到明显的差异，不知道是操作问题还是检测限的问题。1-4倍是依据Q-PCR的结果，样品有定量，并且有beta-actin做内参。

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这个蛋白浓度指？？？

楼主你好，我有个问题想请教下，如胶片所示，最近一段时间我压片总是出现这个问题，1.处，出现如同哑铃一样的条带，有时候中间的连着的，有时候中间连不上，甚至只压出一半，第二个问题，2处。这个是GAPDH，应该是很好压出来的，但是最近也出现条带部分压不出的情况如绿圈所示应该是有条带的，应该是显色到压片这部分出了问题，但是因为我做挺长时间了，所以自己根本就不觉得有什么操作的问题，但是应该肯定有一个我已经形成习惯的步骤出现了问题，请楼主帮忙分析下

步骤，二抗下来，TBST 5X6min，铺在保鲜膜上，GE 的ECL。4度冷藏，拿出来，1比1.两毫升混匀，立即滴加在膜上,膜上TBST没有完全吸干（怀疑这有问题，此处求问，膜上tbst完全干掉再加底物可行否？），几分钟之后，关灯隐隐可见条带，吸干ECL，覆新保鲜膜，剪好大小，放进X射线夹，显影，若干分钟，显影定影，OVER。。

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1、上样体积多大？
2、孵育ECL要混匀，同时不能完全干掉