蛋白质与蛋白组学

1、这个样品你在加入loading的时候煮沸变性了？
2、没有看到沉淀。。。这个protein G你确定加进去了？

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没有看到沉淀，所以当时没有做接下来的离心，洗脱加Buffer这几步。我的这个蛋白做一般的Western的时候不煮蛋白才可以做出条带，所以这次做IP就没打算100度煮沸，煮沸变性应该也是做不出来的。准备加甘氨酸和Tris中和。请高手多多指教。我听别人讲说proteinG 是球状的，很容易粘在枪头上，并且如果枪头来回吹打的话也容易把protein G打散，所以我是把200ul的枪头剪了大概5mm再吸的。但我确定是把它加进去了。期待您的回复，谢谢啦哈

新手弱弱的问一句
蛋白定量后 加buffer 变性后 没有冻存
还能用么

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多久？
一两天后就不行了

体积才10ul。完全混匀，没有干掉

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转膜后丽春红染过膜吗？

没有看到沉淀，所以当时没有做接下来的离心，洗脱加Buffer这几步。我的这个蛋白做一般的Western的时候不煮蛋白才可以做出条带，所以这次做IP就没打算100度煮沸，煮沸变性应该也是做不出来的。准备加甘氨酸和Tris中和。请高手多多指教。我听别人讲说proteinG 是球状的，很容易粘在枪头上，并且如果枪头来回吹打的话也容易把protein G打散，所以我是把200ul的枪头剪了大概5mm再吸的。但我确定是把它加进去了。期待您的回复，谢谢啦哈

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要把protein G充分吹打混匀了才能加

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

需要联系方式请站内短信息联系

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前辈，你好，
小弟正准备做western，新手上路，遇到了很多问题，在这里向你请教几个：
1. 小弟用原代细胞提取的蛋白，含量不怎么高，大概在1-1.3mg/ml左右，而检测的指标蛋白表达量都不怎么高，怎么加样为宜，蛋白质量多少，体积多少？
2. 小弟检测的蛋白分子量均在30-50之间，10%的胶行否？应该选择什么内参？

前辈，你好，
小弟正准备做western，新手上路，遇到了很多问题，在这里向你请教几个：
1. 小弟用原代细胞提取的蛋白，含量不怎么高，大概在1-1.3mg/ml左右，而检测的指标蛋白表达量都不怎么高，怎么加样为宜，蛋白质量多少，体积多少？
2. 小弟检测的蛋白分子量均在30-50之间，10%的胶行否？应该选择什么内参？

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1、细胞蛋白浓度1-1.3也可以了
我们检测的时候上样一般是10-15ug
2、12%的就可以
内参可以选择beta-actin
不同的样品对内参有不同的要求

你好，我最近WB的结果总是会出现如图所示的亮条扭曲的情况，有时候很严重到几乎看不到亮条的。
我确认过做gel的方法，用的12.5%的胶，特意等了2个小时以确保凝固。
染色，wash的时候我也有注意不碰触表面。请问为什么还会不同程度的出现这样的问题。
非常感谢。

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应该是胶凝的不好

1、为什么要一起封闭呢？
当然也可以一起封闭，不过建议分开进行
2、半干我用过1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，15-20K的蛋白转膜20min，0.22um孔径膜

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谢谢老师回复。
1、我们的大师兄让我们一起封闭，原因是可以节省封闭液，我们每次封闭需要5ml封闭液，BSA与TBST混合制成的封闭液。
2、半干转实验室一直用20V恒压转膜，而且不管是什么指标，师兄建议都是转膜1.5h，我们是0.22um孔径的膜，师兄给的原因是：虽然分子量小，但是胶浓度已经限制过分子量大小的问题了，所以运用一致的转膜时间。老师，您的看法是什么？
3、老师，还有一个问题：我们做小分子量的蛋白WB时，怎么跑内参呢？是分两板跑吗？我的小分子蛋白跑时用15%的胶，而内参用10%的胶跑较合适，这种情况下，是不是只能分两版胶跑？对于大分子的蛋白呢？我分别有一个15-20kd的指标和一个240—260kd的指标，这两个指标的内参是不是只能分两版跑？
4、关于曝光时压片时间的问题：是不是做同一个指标的不同老鼠时，在曝光时，曝光时间（压片时间）要一致？压片时间会影响灰度值？
劳您费神，非常感谢老师指导。