蛋白质与蛋白组学

非常感谢您的回答。请问凝胶的时候需要注意些什么吗。凝胶液我有votex混均匀，然后加入凝胶剂，上下晃动10次后倒入模具中。在上层加水等待凝胶。我尝试很多次都这样。以前没出现过这些问题，最近连连出错，请问可能是什么原因。

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用的配胶的试剂是什么？

谢谢老师回复。
1、我们的大师兄让我们一起封闭，原因是可以节省封闭液，我们每次封闭需要5ml封闭液，BSA与TBST混合制成的封闭液。
2、半干转实验室一直用20V恒压转膜，而且不管是什么指标，师兄建议都是转膜1.5h，我们是0.22um孔径的膜，师兄给的原因是：虽然分子量小，但是胶浓度已经限制过分子量大小的问题了，所以运用一致的转膜时间。老师，您的看法是什么？
3、老师，还有一个问题：我们做小分子量的蛋白WB时，怎么跑内参呢？是分两板跑吗？我的小分子蛋白跑时用15%的胶，而内参用10%的胶跑较合适，这种情况下，是不是只能分两版胶跑？对于大分子的蛋白呢？我分别有一个15-20kd的指标和一个240—260kd的指标，这两个指标的内参是不是只能分两版跑？
4、关于曝光时压片时间的问题：是不是做同一个指标的不同老鼠时，在曝光时，曝光时间（压片时间）要一致？压片时间会影响灰度值？
劳您费神，非常感谢老师指导。

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1、封闭液可以回收使用，但是次数不要太多
2、不是吧，不同分子量蛋白转膜当然不能用一致的条件
3、如果想在一块做的话，用梯度胶
4、曝光时间等不可能做到一致，只能在不同胶上设置一个相同的样品做对照，这个样品用各组混合后样品

啊呀，想起来了，还有一个问题。
我最近在做大鼠骨骼肌的4EBP1的蛋白表达和磷酸化表达，其磷酸化表达的抗体是针对两个磷酸化位点的，我做出来的条带都是双条带，而且，磷酸化和蛋白表达都是双条带，无背景，我感觉很奇怪，我想知道这个双条带到底是因为4EBP1的磷酸化位点造成的，还是它自己还有不同的亚基造成的？

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这个蛋白本身就是有多条带呢
正常的

用的配胶的试剂是什么？

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这个配方我用了几年了，虽然做的次数不多，可没有太大的问题，就是最近一个月，不知道怎么了。。。。。。。。。非常感谢。