【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

eric930[使用道具]
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5321

发表于 2013-3-29 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师帮忙解答啊，这个沉淀后的蛋白是出现在55kd左右（BECN的条带），我孵育了BCL-2之后是不是条带也应该出现在55kd左右，我该看那条带的变化啊，，该怎么改进，求解答。。。。

popo520[使用道具]
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5322

发表于 2013-3-29 12:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好！western新手有问题想请教下老师:
1.分子量43的蛋白，制样时应该多大浓度？上样量多少合适？
2.跑胶时跑至分离胶下缘时，溴酚蓝呈波浪形，继续跑了十几分钟，居然变成了一条黄色。。。是什么原因导致的呢？如何避免？
请赐教！谢谢！

TAT[使用道具]
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5323

发表于 2013-3-29 12:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问老师，我想要测血管内皮细胞的一种分泌性蛋白的变化情况，查了下相关的文献发现有的文献里有做内参蛋白，有的没有，这是怎么回事啊？像这种情况下到底用不用做内参蛋白？

IAM007[使用道具]
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5324

发表于 2013-3-29 12:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

版主，我想问下，我这几天做了个WB，backgroud还是挺干净的，但是每个well所在那一条，偏黑，这是什么原因？还有，我有个well 下了个positive control， beta-action是有band的，但是没有显示positive control的band，这是因为primary antibody的问题，还是sample的问题，我的 blocking buffer是： washing buferr 10x 10ml, tween 20 100ul, milk 5g, DDW 90ml,但是我只加了很少的milk，所以这样的solution对primary antibody有影响吗？

@花开花落@[使用道具]
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5325

发表于 2013-3-29 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教版主：
两个问题：
1、我的目的条带看起来毛毛糙糙的或者说是黑色不均匀是怎么回事呢？不像文献上的那么漂亮。
图片如下(箭头所指为目的条带)：

附件

2013-3-29 12:42

42460445.snap.jpg (16.28 KB)

@花开花落@[使用道具]
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5326

发表于 2013-3-29 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2、有时杂带和目的条带难以区分。

附件

2013-3-29 12:42

40569892.snap.jpg (15.57 KB)

@花开花落@[使用道具]
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5327

发表于 2013-3-29 12:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的实验试剂及条件如下：
提取组织蛋白（-70°冻存标本，RIPA+PMSF，超声粉碎，冰上裂解1h），目的蛋白分子量34KD，BSA法总蛋白浓度约5ug/ul，上样量10ul；
12%凝胶电泳，积层胶80V,分离胶100V;
半干转膜；
5%蛋白封闭干粉摇床封闭1h（博士德，室温）；
一抗，santa 1:800，多克隆羊抗，封口袋内4°过夜；
TBST(TWEEN浓度0.1%，PH值7.5)清洗5min*3次；
二抗，中杉金桥，1:5000，摇床室温1h；
TBST(TWEEN浓度0.1%，PH值7.5)清洗5min*6次；
碧云天ECL发光液，1min或2min；
结果重复性也不好，请教版主，谢谢！

xueyouzhang[使用道具]
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5328

发表于 2013-3-29 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

新手求助~~
弄不明白增感屏要怎么用。。。看说明的意思应该是把胶片夹在增感屏之间，光源应该是在增感屏外侧的，可是把增感屏粘到暗盒上之后，NC膜要放哪啊？是和胶片一起夹在增感屏之间？还是不粘增感屏，把胶片放在增感屏内侧，把膜放在外侧啊？谢谢~~

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5329

发表于 2013-3-29 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主，我现在在CHO细胞做融合蛋白表达（即A－连接肽－B），单独A或B在CHO中表达都可以通过WB检测到，且表达量比较大，但是融合蛋白表达量较低，也只能检测到A，死活都检测不到B，但是分子量的大小就是融合蛋白的大小，请问是什么原因？

=============================

表达这一块我就不太懂了

A与B单独存在的情况下能检测到吗？
可能B的抗体不能识别B

NBA[使用道具]
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5330

发表于 2013-3-29 12:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教老师做免疫共沉淀的问题，这个实验刚开始做，有些不明白的地方，我用的是BECN（santa. sc11427.60kd）沉淀蛋白，检测BCL-2的变化，我的实验步骤是

1. 细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
2.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约200微克至1毫克，加20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2h。

3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

4. 用BECN沉淀蛋白（BECN抗体为santa的货号为sc-11427，60kd）
C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1个小时
C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，
C4.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心
C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，SDS-PAGE电泳，
5、转膜，封闭都按照做WB的要求，一抗孵育的是BCL-2(26KD),

左边的条带为沉淀后的蛋白，右边的是提取细胞上清 SDS-PAGE染色后

曝光后的图片，条带很亮，有些拖尾，在55kd左右和26kd左右都有条带

老师帮忙解答啊，这个沉淀后的蛋白是出现在55kd左右（BECN的条带），我孵育了BCL-2之后是不是条带也应该出现在55kd左右，我该看那条带的变化啊，，该怎么改进，求解答。。。。

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