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标题:【讨论帖】western blot问题解答

eric930[使用道具]
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发表于 2013-3-29 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从Abcam公司购买的抗体：Anti-Aggrecan ARGxx antibody [BC-3] (ab3773)。其中说明书中这两段话不是很清楚，请高手指点，谢谢！
1. Recognises the aggrecanase (ADAMTS-1, -4 & -5)-generated N-terminal neoepitope ARG after cleavage between amino acids EGE and ARG within the interglobular domain of aggrecanase-catabolised aggrecan (Human aggrecan sequence enumeration). This antibody will not recognise the sequence ...ARG.. if it is in the non-cleaved intact aggrecan protein core; i.e. it will only recognise the aggrecanase generated neoepitope ARG... Samples need to be deglycosylated for epitope recognition.
2. Antibodies tested only in recombinant samples are not covered for use on endogenous samples. Please check the datasheet for information on tested species.
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-3-29 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主您好，请教以下几个问题：
1、有的一抗会标明 样品必需是non-reducing and non-denaturing，这是什么意思？
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗？与需要变性的样品准备有什么不同之处？
谢谢！
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gogo[使用道具]
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发表于 2013-3-29 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，今天是我第一次做斑点印迹实验，可是为什么我的片子洗出来贴着膜的部分整个都是黑的，而点了样，原本应该发光的地方却有点发白呢。。。
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ALALA[使用道具]
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发表于 2013-3-29 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下WB的问题，我做的是大鼠肾脏动物蛋白 内参是GAPDH 另两个分子量在52和90左右，感觉很不稳定，不明白 条件和以前一样的 现在出不来
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莲花白[使用道具]
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发表于 2013-3-29 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主,你好,最近一直为WB困惑,下面是我的胶片.同样的重复做了三次,上面一排是内参,下面的是目的蛋白,分子量是27KD.上样量30ug,胶是15%的,电泳是80V,110V,共80分钟;转膜是湿转,200mA,时间60分钟.封闭是5%脱脂牛奶,一抗浓度1:500过夜,二抗1:5000两小时,分别用TBST洗3次,每次洗10分钟.目的蛋白的条带能看的到吗,背景是不是有点脏,该如何解决,谢谢.
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发表于 2013-3-29 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，

我在做一个膜蛋白的western blot，它的二聚体分子量是200kd 左右，我跑出来的时候一般是2条带，分别在100kd 和200kd. 不知道该如何跑出只有200kd 的蛋白。谢谢！！

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这种情况下100K的一般是去不掉了
另外100K的条带存在也不影响检测效果
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发表于 2013-3-29 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我昨天跑western，转膜后膜上marker的条带都没看见，膜、电极、胶都放对了，膜也正确处理了，后来用丽春红泡了一会，就隐约看见了72的一个条带。
我今天跑western又出现一个问题，我和师姐同时跑胶，在同一个槽子里面跑的，她跑12%的胶，我跑10%的胶，理论上她的应该慢于我，结果我的比她的还要慢，不知道哪里出问题了？这两天练习western，总出现不同的问题，始终找不到问题出在哪里，困扰！麻烦你帮我解答问题了，谢谢

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样品电泳后染胶了吗？
不要着急做后面的检测
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发表于 2013-3-29 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主您好，请问用上清直接进行WB实验是什么意思？谢谢！

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如果在上清中用WB检测不到这个蛋白
做后续的实验就没有意义
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发表于 2013-3-29 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主您好，我和deba1116的情况差不多。
我实验细胞来源是兔椎间盘组织，需要检测Collagen I 和 Collagen II两个胶原的蛋白量，内参B-atcin条带每次都能做出来，但目的蛋白都是空白的。我用的是碧云天的强PIPA裂解液，蛋白量也用到了60ug，也加大了一抗浓度，但都得不到条带，两个目的蛋白所用的一抗通过细胞免疫荧光实验检测表达都很好，这两种胶原在椎间盘组织中的含量很丰富，而且说明抗体也不存在问题。
1、现在可能是我细胞裂解这一步出现问题，是不是胶原的三级结构没有打开呢？胶原有三条链，使用的RIPA裂解液不能解开这些链，从而导致抗体不能结合，有这种可能吗？我查文献，有的人在提取蛋白之前，加入胃蛋白酶常温孵育2小时，然后做后续的蛋白提取，胃蛋白酶在这是起到解链的作用吗？
2、这两种胶原在组织中含量很丰富，80%的细胞分泌这些胶原，不应该没有表达，我觉得是样品没有处理好，但为什么内参又能跑出条带呢？
疑惑请赐教。谢谢！

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这两个蛋白分子量比较大，不是很好检测
我检测过一些特异性不是很好
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 小中大
从Abcam公司购买的抗体：Anti-Aggrecan ARGxx antibody [BC-3] (ab3773)。其中说明书中这两段话不是很清楚，请高手指点，谢谢！
1. Recognises the aggrecanase (ADAMTS-1, -4 & -5)-generated N-terminal neoepitope ARG after cleavage between amino acids EGE and ARG within the interglobular domain of aggrecanase-catabolised aggrecan (Human aggrecan sequence enumeration). This antibody will not recognise the sequence ...ARG.. if it is in the non-cleaved intact aggrecan protein core; i.e. it will only recognise the aggrecanase generated neoepitope ARG... Samples need to be deglycosylated for epitope recognition.
2. Antibodies tested only in recombinant samples are not covered for use on endogenous samples. Please check the datasheet for information on tested species.

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第一点有点长，我就不解释了
第二点这个抗体只适用于检测重组蛋白
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