蛋白质与蛋白组学

版主您好，请教以下几个问题：
1、有的一抗会标明 样品必需是non-reducing and non-denaturing，这是什么意思？
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗？与需要变性的样品准备有什么不同之处？
谢谢！

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1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的

您好，今天是我第一次做斑点印迹实验，可是为什么我的片子洗出来贴着膜的部分整个都是黑的，而点了样，原本应该发光的地方却有点发白呢。。。

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调整一抗、二抗稀释度

请教一下WB的问题，我做的是大鼠肾脏动物蛋白 内参是GAPDH 另两个分子量在52和90左右，感觉很不稳定，不明白 条件和以前一样的 现在出不来

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目的不稳定还是？

楼主,你好,最近一直为WB困惑,下面是我的胶片.同样的重复做了三次,上面一排是内参,下面的是目的蛋白,分子量是27KD.上样量30ug,胶是15%的,电泳是80V,110V,共80分钟;转膜是湿转,200mA,时间60分钟.封闭是5%脱脂牛奶,一抗浓度1:500过夜,二抗1:5000两小时,分别用TBST洗3次,每次洗10分钟.目的蛋白的条带能看的到吗,背景是不是有点脏,该如何解决,谢谢.

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二抗用1:10000

1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的
谢谢版主。

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我的抗体说明书上写的是：The product does not react with the thermally-denatured molecule. 是否指的就是non-denaturing呢？还是指在加的loading buffer中可以有DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS，而仅仅不加热变性呢？
还有一个问题请教版主：我们购买的一抗要怎么验证这个抗体的真假？有专门的防伪网站吗？
谢谢！

这两个蛋白分子量比较大，不是很好检测
我检测过一些特异性不是很好

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请问版主最后有没有做出结果，能不能提供抗体的信息呢？

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。
特此向NBA老师请教，谢谢!

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什么叫在浓缩胶里分离了，是不是加到1道，结果漏到3道旁边甚至浓缩胶和分离胶的交界面去了？如果是我也遇到过，是因为枪压得太狠了，枪头像楔子一样把玻璃板顶开了缝隙，就漏出去了，如果不是我就不知道了，等版主吧