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标题:【讨论帖】western blot问题解答

lxh031[使用道具]
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5401
 

老师您好,最近我做了两次WB,有两个问题想请教:
1.电泳的时候样品跑不成一条直线,而且连marker也看不大清楚,图左数第二个孔是marker。
2.跑胶的条件是恒流35mA,同实验室的师兄一般90min都可以跑完,但我的跑很慢。
请问这是否是胶的问题?还是样品问题?
谢谢!!
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dog002[使用道具]
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5402
 

楼主您好!马上要做western,现在准备订HES1抗体,在网上找了一些,现在不知道选哪个了,有epitomics公司的EPR4226,这个是单抗效价比较高1:1000到1:10000稀释的。还有santa的sc-25397是多抗1:100到1:1000稀释,好几篇文献上写的用的这个。请问选单抗好还是多抗好?epitomics公司抗体之前用过一只GAPDH还不错,不知道其他产品怎么样,楼主用的多希望指点一下!谢谢!
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5403
 
你好,我想跑20KD的目的蛋白,43KD的内参。
1.请问一下,电泳积层胶80V,分离胶100V, 跑多长时间合适呢??
2. 我的24KD的目的蛋白总是跑不出来,是不是我制胶有什么问题?因为每次胶染色后20KD的蛋白都没有颜色。
3.我有好几次制的分离胶都有有分层,不知道是什么原因?胶染色后分离胶上面明显深浅不一。
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5404
 
1.我今天用您说的<湿转,300mA 恒流,40KD,30-40min>,我转了40min,转膜之后缓冲液很烫,虽然我也用冰浴,而且转移槽里还放了冰袋,温度这么烫对蛋白有影响吗?
2.我的marker转的很不好,最近经常碰到,marker转过后不是直线(横向的单个marker的线条),单个的marker它会往上翘又往下去,一头变粗,要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带,这个是什么问题啊
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老师您好,最近我做了两次WB,有两个问题想请教:
1.电泳的时候样品跑不成一条直线,而且连marker也看不大清楚,图左数第二个孔是marker。
2.跑胶的条件是恒流35mA,同实验室的师兄一般90min都可以跑完,但我的跑很慢。
请问这是否是胶的问题?还是样品问题?
谢谢!!

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用的什么loading啊?
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楼主您好!马上要做western,现在准备订HES1抗体,在网上找了一些,现在不知道选哪个了,有epitomics公司的EPR4226,这个是单抗效价比较高1:1000到1:10000稀释的。还有santa的sc-25397是多抗1:100到1:1000稀释,好几篇文献上写的用的这个。请问选单抗好还是多抗好?epitomics公司抗体之前用过一只GAPDH还不错,不知道其他产品怎么样,楼主用的多希望指点一下!谢谢!

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santa的就别试了
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你好,我想跑20KD的目的蛋白,43KD的内参。
1.请问一下,电泳积层胶80V,分离胶100V, 跑多长时间合适呢??
2. 我的24KD的目的蛋白总是跑不出来,是不是我制胶有什么问题?因为每次胶染色后20KD的蛋白都没有颜色。
3.我有好几次制的分离胶都有有分层,不知道是什么原因?胶染色后分离胶上面明显深浅不一。

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内参做的很好嘛?
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5408
 
上图!左侧四个,目的条带出来了,但是背景太重了,上样量50ug,转膜300ma,1小时,牛奶封闭1小时,一抗室温1小时,二抗室温半小时,ecl--曝片就这样了................................................... 太杯具了....求大牛解释!

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二抗稀释度加大一倍
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1.我今天用您说的<湿转,300mA 恒流,40KD,30-40min>,我转了40min,转膜之后缓冲液很烫,虽然我也用冰浴,而且转移槽里还放了冰袋,温度这么烫对蛋白有影响吗?
2.我的marker转的很不好,最近经常碰到,marker转过后不是直线(横向的单个marker的线条),单个的marker它会往上翘又往下去,一头变粗,要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带,这个是什么问题啊

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1、没有影响
2、转之前marker条带直吗?
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bongte[使用道具]
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1、没有影响
2、转之前marker条带直吗?

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1.我今天用您说的<湿转,300mA 恒流,40KD,30-40min>,我转了40min,转膜之后缓冲液很烫,虽然我也用冰浴,而且转移槽里还放了冰袋,温度这么烫对蛋白有影响吗?
2.我的marker转的很不好,最近经常碰到,marker转过后不是直线(横向的单个marker的线条),单个的marker它会往上翘又往下去,一头变粗,要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带,这个是什么问题啊,

2 转膜之前电泳后是直的,也很好看,但是转膜之后就不行了,就是我上面说的情况,有查到说是新海绵会出现marker转的不好,但是我的是旧的海绵啊,不知道为什么
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