蛋白质与蛋白组学

β-actin 内参都做不出来真心崩溃！
转膜后Marker清晰，其他条带的比较浅，1%BSA封闭，1:1000稀释一抗，室温3h,TBST洗膜4次，每次5分，1:2000稀释羊抗鼠HRP，室温3h,TBS洗膜同上，加北京普利来ECL，按说明操作，什么也没有。求教！

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转膜后丽春红染色了吗

您好！请教一个关于二聚体的问题，我在真核细胞中表达一个带GFP的融合蛋白，融合蛋白的大小在100KD左右，但用western-bloting检测，条带每次都在210KD左右，是不是形成了二聚体？这次，我在样品buffer中加大了巯基乙醇的量，100度煮5min，但做western-bloting检测时，条带仍在210KD左右。我想问的是：怎样才能得到单体的融合蛋白大小的条带？谢谢！

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1、巯基乙醇是否挥发？
2、可以用DTT替代
3、用多大浓度的胶？是marker显示的具体位置还是大致看的位置在210KDa？

我现在用western做分子量300KD左右的蛋白P300，分类胶6%，浓缩胶3.5%；电泳条件：恒压100V，转膜条件：300ma，6h，放在冰盒里转的，
感觉电泳没问题，但转膜后marker可见，丽春红染色后所有的蛋白都没染上，说明下：1.转膜是今天夜里转的，中间比较困，睡着了，6点多去时，转膜已经结束1：30分钟，后用丽春红染的；这期间没有向
里面加冰块，结束时温度感觉也不高，想问下转膜温度对转膜效果影响大吗，这个期间需要加冰降温吗？2.我昨天做过同样条件，结果立春后染色后出现条带？但是比较浅，中间也没控制温度。3.请教下fangweibin119老师有没好的经验，传授下，不胜感激！谢谢！

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1、转膜停了后，时间长点拿出来是没有特别大的影响的。特别是大分子，更不可能有很大的影响
2、大分子量的蛋白本身就比较少
3、需要降温，但是即使是降温，温度也会比较高，只是不要过高就可以
4、300mA，转膜2h30min到3h足够了
5、内参做的怎么样？
抗体的质量怎么样
样品中是否有文献支持有p300的表达？

请问你做动物的话也是做3个吗？3个的话是否有统计学意义？出来条带之后是不是有个分析软件分析。会出一些数据的吗？是不是需要计算均值标准差这些？论文中[t(14)=3.36; P=0.005]，t是表示什么？(F(5,55) =7.437, p < 0.0001）F是表示什么？括号中（5,55）又是代表什么呢？

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后面的那些统计学上的东西我就不懂了
问问学统计的
一般都是3只动物来做统计了
要用专业软件进行读数

老师，你好，我做WB时洗出来的片子背景太亮，什么原因？另外，我从公司订的特异抗体，但做出来之后结果显示好几条带，是因为抗体不特异吗？WB能检测出其复合体的形式吗？谢谢您！

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1、是买的商业化抗体还是自己设计抗原定制的抗体？
2、目的分子量处的条带清晰、特异吗？
有图吗

您好：
刚开始做western， 内参大小43结果曝出的片子内参在55-43之间，且背景不干净发黑，想问一下怎么回事。二抗在4℃孵了一小时不知道有没有关系。

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调整一抗与二抗的稀释度
二抗孵育时间室温30min就足够了

1、巯基乙醇是否挥发？
2、可以用DTT替代
3、用多大浓度的胶？是marker显示的具体位置还是大致看的位置在210KDa？

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1、我先在loading buffer中加入巯基乙醇，再100度煮样品5Min，是否会导致巯基乙醇挥发？如何判断？若用DTT，其用 量是？在遇到二聚体时，应该采用哪种较有效的方法处理？
2、我用10%的分离胶，210KD是大致位置。
非常感谢！

1、我先在loading buffer中加入巯基乙醇，再100度煮样品5Min，是否会导致巯基乙醇挥发？如何判断？若用DTT，其用 量是？在遇到二聚体时，应该采用哪种较有效的方法处理？
2、我用10%的分离胶，210KD是大致位置。

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1、5×loading中 DTT浓度为300mM
2、用10%的胶，分不清楚210K的位置哦