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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-29 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想问个关于一抗的问题 我买的抗体说明书上有说明Cellular Localization：Nucleus | 那是不是说我应该提细胞的核蛋白才能跑得出来 如果提总蛋白就测不出来？　　还有说明书上没有推荐的二抗浓度（我看有的抗体是有推荐的），那我应该用多少呢？？　　还有听说二抗用带荧光的那种没有需加染色剂的效果好　是这样吗　　　多谢多谢

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啊 补充问一下 需不需要买待测蛋白的标准品来作对比呢
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没找到，所以打算换抗体！

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你后来W-B怎么样了？
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发表于 2013-3-29 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师你好，现在做WB遇到以下几个问题希望能帮忙解答一下：
1.目的蛋白76kDa，内参是GAPDH，恒流湿转的话电流和时间大概应该是多少？之前有用过300mA转2h和400mA转40min是否时间太长？
2.最近发现转完膜之后marker在正面条带清晰，但是在膜的背面也能看到，请问这是说明转过头了吗？
3.用5%脱脂奶粉常温封闭膜1h，封闭完之后应该用什么洗膜再加一抗？TBST吗？
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发表于 2013-3-29 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有一个问题忘记问了…
膜结合好二抗之后用TBST和TBS洗膜，如果需要过一段时间（不太长，大概1-2h）再用ECL发光的话膜应该怎么样暂时保存比较好？可以一直放在TBST或者TBS里面吗？然后使用完的膜如果还想保存较长时间的话应该怎么保存？
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发表于 2013-3-29 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大侠：Marker和内参不是一回事儿吗？Marker是什么啊谢谢
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发表于 2013-3-29 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想问个关于一抗的问题 我买的抗体说明书上有说明Cellular Localization：Nucleus | 那是不是说我应该提细胞的核蛋白才能跑得出来 如果提总蛋白就测不出来？　　还有说明书上没有推荐的二抗浓度（我看有的抗体是有推荐的），那我应该用多少呢？？　　还有听说二抗用带荧光的那种没有需加染色剂的效果好　是这样吗　　　多谢多谢

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提取总蛋白亦可
二抗没有说明书？
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发表于 2013-3-29 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好 我请教的问题如下：
我在page、封闭、孵育一抗、二抗之后采用ECL试剂盒曝光
但是发现我的胶片上的图像就是我PVDF膜的轮廓（有的时候还有点儿花）
请问这是什么原因？

十分感谢！

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曝光多久？
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发表于 2013-3-29 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好，现在做WB遇到以下几个问题希望能帮忙解答一下：
1.目的蛋白76kDa，内参是GAPDH，恒流湿转的话电流和时间大概应该是多少？之前有用过300mA转2h和400mA转40min是否时间太长？
2.最近发现转完膜之后marker在正面条带清晰，但是在膜的背面也能看到，请问这是说明转过头了吗？
3.用5%脱脂奶粉常温封闭膜1h，封闭完之后应该用什么洗膜再加一抗？TBST吗？

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我们常用300mA恒流
转1h即可
转过一点也没问题
用什么封闭、孵育抗体就用什么缓冲液来洗膜
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发表于 2013-3-29 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大侠：Marker和内参不是一回事儿吗？Marker是什么啊谢谢

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不是一回事
marker是用于确定分子量位置的
内参适用于做上样等误差校正的
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发表于 2013-3-29 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我也要做WB，新手，实验设计中，其中好多问题不懂想请教谢谢老师

1内参需不需要买标准蛋白，还是只卖内参的一抗、；内参怎么选呢如果分子量和目的蛋白差不多的 话是不是到时候就跑不开了

2我要测大鼠的MMP-2（72kDa），MMP-9（92kDa），β-DG（43kDa），和P38不知道要买哪个公司的我查了一下abc的好贵都四千多其他性价比高点的有哪个公司的，迷茫中

3除了一抗以外WB中所需的试剂有哪些需要买进口的？买国产的可以吗，您觉得哪个公司的好一些呢

初来乍到，问题颇多，谢谢大侠指教

刚才您的解答我看不见可以再帮我发一遍吗谢谢您
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