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标题:【讨论帖】western blot问题解答

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是一回事
marker是用于确定分子量位置的
内参适用于做上样等误差校正的

===================================================================

大侠那我要是测不同的蛋白就需要购买不同的Marker吗，你建议一般买那个公司的谢谢
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u234[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
曝光多久？

================================================================================

15 min
我现在更改了曝光方式，以前用的是胶片；现在改用公共实验室的分析仪器，坐等结果；随时update！
祝好 多谢！
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提取总蛋白亦可
二抗没有说明书？

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我是说有的一抗说明书上会有推荐的二抗浓度 您的意思是如果没有就按照二抗说明书是吧 另外，听说有两种二抗，一种是带荧光的 一种是不带荧光需要染色剂的 哪种效果好一点呢？？ 另外需不需要用待测蛋白的标准品（单体）来做阳性对照呢一般？？（因为我测得东西还不知道到底存不存在于被测细胞中。。。）
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glass[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好老师：我现在要做的目的蛋白分子量540kda，需要用梯度胶吗？内参选择转膜跑胶的条件是怎样的？谢谢
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发表于 2013-3-29 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主您好。
最近在做Collagen Type I 这个蛋白的WB，一抗中注明需要non-reducing和non-denaturing的蛋白样品，我根据native page 的protocol 完成实验：1、配制的细胞裂解液中去除SDS；2、上样loading buffer中去除SDS和DTT等还原剂；3、PAGE制备5%的分离胶和层积胶，均不含有SDS；4、样品不加热变性；5、running buffer中不含SDS；6、电泳110V（实际只有60V），跑得比较慢，大概8个小时溴酚蓝到达底部；7、转膜恒压80V，3h；8、封闭1h，洗膜6次，5min/次，一抗：1:500，4度过夜，洗膜6次，5min/次，二抗：1:1000，之后加ECL，曝光。（丽春红染色及曝光X片见下图）
我的问题是：1、没有变性的样品电泳后，因为分子量比较大，都集中在分离胶的最上面，从我曝光的情况来看，条带很模糊，是不是抗体特异性不好或者是我的样品在电泳和转膜后已经变性？
2、转膜的时间是不是要延长，并把电压或电流减小，因为电流过大温度过高会导致蛋白变性。
3、版主以前是否有做过native PAGE的经验，以上的操作是否有错误，请指导一下，谢谢。

丽春红染色膜左边的的条带是预染Mark，在最上面可以看到被染色的蛋白条带；曝光的X线片在相应的位置也有条带，但不是很明显。而且在曝光完这两个胶片后，在次曝光就什么也没有了。


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33号[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师，你好

我是个新手，第一次做的时候ECL发光后能看到膜上明显的荧光，但是2min，5min，10min分别曝光后根本没有条带。片子完全是透明的。求解~
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发表于 2013-3-29 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有一个问题忘记问了…
膜结合好二抗之后用TBST和TBS洗膜，如果需要过一段时间（不太长，大概1-2h）再用ECL发光的话膜应该怎么样暂时保存比较好？可以一直放在TBST或者TBS里面吗？然后使用完的膜如果还想保存较长时间的话应该怎么保存？

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1.这个转膜时间是有点长，具体时间是根据你的湿转液配方而定；
2.奶粉封闭完可以不洗膜（如果你的抗体也是用奶粉稀释的），如果不是，就用TBST洗膜‘
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发表于 2013-3-29 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问前辈能不能给详细讲下如何进行Stripping，包括液体配制，如何洗涤，使用次数？万分感谢
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newway[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们常用300mA恒流
转1h即可
转过一点也没问题
用什么封闭、孵育抗体就用什么缓冲液来洗膜

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前辈我也是用这个条件转膜，我想问一下这个条件适用于多大分子量的蛋白？大分子量的应该增加电流还是增加时间？
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milkdog[使用道具]
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发表于 2013-3-29 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好！我是新手，做了两次WB，背景是亮的，条带是黑的，这是怎么回事呢？
还有，actin跑得粗细不一，同一上样孔的蛋白跑出了几个条带。求解!
希望得到您的指导！
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