蛋白质与蛋白组学

您好，我也要做WB，新手，实验设计中，其中好多问题不懂想请教谢谢老师

1内参需不需要买标准蛋白，还是只卖内参的一抗、；内参怎么选呢如果分子量和目的蛋白差不多的 话是不是到时候就跑不开了

2我要测大鼠的MMP-2（72kDa），MMP-9（92kDa），β-DG（43kDa），和P38不知道要买哪个公司的我查了一下abc的好贵都四千多其他性价比高点的有哪个公司的，迷茫中

3除了一抗以外WB中所需的试剂有哪些需要买进口的？买国产的可以吗，您觉得哪个公司的好一些呢

初来乍到，问题颇多，谢谢大侠指教

刚才您的解答我看不见可以再帮我发一遍吗谢谢您

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1、内参不需要标准蛋白。买内参一抗即可
常用内参有三种GAPDH（37K），b-actin（43K），b-tubulin（53K）
有时候分子量差的不多的话可以stripping后再孵育内参
2、看看CST的吧，MMP-2、MMP-9，P38我都用过CST的，不错
3、我们用的试剂90%都是进口的
国产的我只用：BSA（这个不好进口），NaCl，无水甲醇等，其他都是用进口的，以Sigma为主

大侠那我要是测不同的蛋白就需要购买不同的Marker吗，你建议一般买那个公司的谢谢

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marker一般买一种就可以了
marker有一个分子量范围，选择一下即可。我们常用fermentas的

您好老师：我现在要做的目的蛋白分子量540kda，需要用梯度胶吗？内参选择转膜跑胶的条件是怎样的？谢谢

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需要梯度胶
如果不做内参的话
可以选择普通的6%的分离胶

版主您好。
最近在做Collagen Type I 这个蛋白的WB，一抗中注明需要non-reducing和non-denaturing的蛋白样品，我根据native page 的protocol 完成实验：1、配制的细胞裂解液中去除SDS；2、上样loading buffer中去除SDS和DTT等还原剂；3、PAGE制备5%的分离胶和层积胶，均不含有SDS；4、样品不加热变性；5、running buffer中不含SDS；6、电泳110V（实际只有60V），跑得比较慢，大概8个小时溴酚蓝到达底部；7、转膜恒压80V，3h；8、封闭1h，洗膜6次，5min/次，一抗：1:500，4度过夜，洗膜6次，5min/次，二抗：1:1000，之后加ECL，曝光。（丽春红染色及曝光X片见下图）
我的问题是：1、没有变性的样品电泳后，因为分子量比较大，都集中在分离胶的最上面，从我曝光的情况来看，条带很模糊，是不是抗体特异性不好或者是我的样品在电泳和转膜后已经变性？
2、转膜的时间是不是要延长，并把电压或电流减小，因为电流过大温度过高会导致蛋白变性。
3、版主以前是否有做过native PAGE的经验，以上的操作是否有错误，请指导一下，谢谢。

丽春红染色膜左边的的条带是预染Mark，在最上面可以看到被染色的蛋白条带；曝光的X线片在相应的位置也有条带，但不是很明显。而且在曝光完这两个胶片后，在次曝光就什么也没有了。

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没做过native page

老师，你好

我是个新手，第一次做的时候ECL发光后能看到膜上明显的荧光，但是2min，5min，10min分别曝光后根本没有条带。片子完全是透明的。求解~

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那就是胶片的问题喽

请问前辈能不能给详细讲下如何进行Stripping，包括液体配制，如何洗涤，使用次数？万分感谢

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stripping这个简单
液体的配制这个不方便告诉你

前辈我也是用这个条件转膜，我想问一下这个条件适用于多大分子量的蛋白？大分子量的应该增加电流还是增加时间？

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增加时间

老师您好！我是新手，做了两次WB，背景是亮的，条带是黑的，这是怎么回事呢？
还有，actin跑得粗细不一，同一上样孔的蛋白跑出了几个条带。求解!
希望得到您的指导！

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你说的是哪一步？ 背景是亮的，条带是黑的没理解
有图片吗

1、内参不需要标准蛋白。买内参一抗即可
常用内参有三种GAPDH（37K），b-actin（43K），b-tubulin（53K）
有时候分子量差的不多的话可以stripping后再孵育内参
2、看看CST的吧，MMP-2、MMP-9，P38我都用过CST的，不错
3、我们用的试剂90%都是进口的
国产的我只用：BSA（这个不好进口），NaCl，无水甲醇等，其他都是用进口的，以Sigma为主

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谢谢您的给我的帮助 最近一直也在查阅过程中 发现自己有的问题很低级 感谢您耐心的解释 真心感谢！！