蛋白质与蛋白组学

老师，你好

我是个新手，第一次做的时候ECL发光后能看到膜上明显的荧光，但是2min，5min，10min分别曝光后根本没有条带。片子完全是透明的。求解~

===================================================================

我也遇到过这种情况，你会不会也是贴保鲜膜的时候，没铺平，导致荧光猝灭了啊。

大师，我又来提问了。。。
我做的是dot blot，封闭条件是10 %的脱脂牛奶4 °C下封闭18 h，一抗稀释度为1:2000，二抗稀释度为1:50000，可是为什么我的图出来是这个样子的。。。背景比点了样的地方还亮，而且中间还有一块不亮，像缺了一块似的。。。

===================================

二抗继续稀释撒
另外二抗孵育条件是什么？洗膜条件是什么？

您好！这是我转膜后丽春红染膜图。（ＮＣ膜）
问题：上面的是大蛋白，染色深，下面染色很浅，连GAPDH,beta-actin内参所在的位置都很浅，这是不是说明下面的小蛋白已经转过去了？我的转膜液配方是Tris base 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，定容至1000ml；转膜条件是湿转，200mA，120min。
如果是转过去了，应该再缩短一点转膜时间？请问大概要多久？另外，这个转膜液我看有一些是加SDS，有一些是不加的，请问一般哪个好一些？
谢谢老师~！

=====================================================

1、转膜没问题
2、我认为问题出现在：样品
你可以在SDS-PAGE完成后，用考马斯亮蓝染一下胶看看（不转膜）

您好！我检测骨骼肌细胞膜蛋白和浆蛋白的FAT/CD36的表达，内参用的β-actine，采用的BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，之前预实验做内参出来过一次，感觉条带模糊，表达量高，且怀疑显色时间过长，最近几次内参效果都不理想，要不就是条带很淡很淡，要不就是很模糊。这次分别用5%BSA和2%牛奶封效果都不好。
另外，预实验用的人家实验室的光明脱脂奶粉，4%牛奶封闭可以，但我自己从淘宝上买回来的同样4%的牛奶觉得好浓，且条带一直出不来或很淡（目的蛋白和内参均是），改用5%BSA目的蛋白可出条带，但杂带也较多。请问这跟封闭有关系吗？我买的奶粉是不是有问题？请老师指教！

================================================

1、我们用伊利的高钙脱脂奶粉，效果没问题
2、我们封闭及稀释一抗用3%BSA-TBST，稀释二抗用5%奶粉-TBST
3、调整beta-actin的稀释度试试
4、还有二抗的稀释度也需要调整

大师，我又来提问了。。。
我做的是dot blot，封闭条件是10 %的脱脂牛奶4 °C下封闭18 h，一抗稀释度为1:2000，二抗稀释度为1:50000，可是为什么我的图出来是这个样子的。。。背景比点了样的地方还亮，而且中间还有一块不亮，像缺了一块似的。。。

==============================================================================================================

身边有人也曾遇到过类似的情况，建议你换新的膜试试；
而且封闭不必10%的脱脂牛奶，1%的BSA或者5%的Tween20-PBS，37℃ 30min-2h就可以了，如果你的膜没问题，估计问题就出在这，封闭液浓度过高封闭时间过长，有可能会对你点膜的地方造成一种“漂洗”的作用

1、如果整张膜都发亮
主要原因在二抗稀释度是否合适
其次有些一抗也会造成发亮的背景
再次国内有些公司的ECL本身就有荧光背景
2、拍照是黑的指什么？用CCD拍照还是？

==============================================================================================================

中杉金桥的羊抗鼠IgG/HRP 1000和2000倍稀释 都亮，还要稀释？国产货效价这么高？用CCD拍的。黑的就是没背景啊，神马都没有。按理，发亮应该拍出来是白的啊！？郁闷，做了N次了，背景要么全白，要么全黑，就是没带！

二抗继续稀释撒
另外二抗孵育条件是什么？洗膜条件是什么？

=====================================================

二抗孵育条件是室温下1 h，洗膜条件是TBST洗5次，每次10 min