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本人做蛋白已经有两个月了，但是一直没有把目的蛋白做出来，想请教群里面的高手，希望能帮帮小弟。我的目的蛋白是一个45kd大小的蛋白，是连接在pEGFP-N1载体上的，与标签蛋白EGFP属于融合表达，EGFP大小是27KD，所以我检测的蛋白大小应该就是72KD，我内参使用的ACTIN，大小为45KD。做了很多次了，一般都是内参一般比较清晰明显，但是目的基因要么条带很弱，要不就是杂带很多。
下面我说说我最近的一次实验的实验条件，我的浓缩胶的浓度是5%，分离胶的浓度是12%，膜是用的0.22的NC膜。转膜条件是：转膜液含有20%的甲醇，膜长6.5，宽3.2，转膜时间80min,电流大小为60mA,转后用TBST稍微洗了下，然后用5%的脱脂奶粉室温，最低转速，封闭2h .然后TBST: 3X5min,TBS :5min,一抗孵育：目的1：200，内参1：2000。4度过夜。次日洗膜：TBST: 3X5min,TBS :5min,。二抗孵育2h，目的和内参都是1：2000。洗膜TBST: 3X5min,TBS :5min.
结果，内参十分明显，暴光时间在2分左右，目的基因暴光时间在15分钟，且条带不是那种完整的直线，有些中间没有，感觉是孔的边缘还比较亮一点。
我问过我们实验室以前做过蛋白的师兄，师兄说可能是我转膜的时间太长了，但是我觉得目的蛋白72KD，内参45KD，如果时间长了，内参会比较浅才对的。还有的就是我的分离胶是用的12%的浓度，大了点，对于转膜的时候会产生很大的影响吗？
这个是内参actin的图片，大小在45kd左右。曝光时间为2min左右。
这是目的基因suv39h1的图片，大小在72kd左右曝光时间有15min左右
