蛋白质与蛋白组学

您好，关于WB一些统计学的问题请教您：
1、细胞蛋白提取：我用的是细胞瓶养细胞，经过药物处理一定时间后提蛋白，别人说，最少提三批以上，请问这三批可以一次性提吗？（相当是重复），还是一次提一批，在不同时间提三批。
2、WB结果用软件分析时，上面三批蛋白中，每一批选一个满意结果（共三个）用于统计学分析？
谢谢

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第一个问题：正常的做法是同时培养多瓶细胞，同一药物处理三至四瓶细胞做平行对照，避免只做一管引起的误差。
要同时刺激，同时提取
提取蛋白后这几个平行对照要做三次重复
这是最严谨的做法
供你参考
二：做统计是需要样本数的
选一个你怎么做统计？
建议至少3个平行对照

有个问题一直想知道，请教老师：
0.75mm和1.0mm的胶，在电泳和转移的时间和电流方面有什么不同要求吗？
谢谢！

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电泳时基本没差别
由于胶厚度的不同转膜时如果相同的电流那么转移时间要缩短
这是要根据不同的胶厚度做预实验的

不好意思老师，我太心急了，所以说话没什么调理，现在我将我的问题整理一下：
1.如何能够选择正确的实验条件（如胶的比例浓度，电泳大小、时间，一抗二抗孵育条件......）从而建立适合我的蛋白质的实验方法呢？（我的标准蛋白是Albumin Egg，MW44287Da）。
2.你们说所的预染marker，内参对照是什么意思呢？具体如何操作？
3.前两次的实验结果都让我有些困惑:电转之后的膜用李春红染色后没有发现条带，而凝胶用G250染色后也没有条带（电转之前是有的），我怀疑是三明治没有做好跑到溶液中去了~但是我还是继续往下做了封闭接一抗二抗最后用ECL显色~最后还是什么都看不见~我又试探性的将膜再次用李春红染色，结果竟然出现了条带......老师能解释一下为什么吗？
4.我使用的是PVDF膜，有的资料上说预处理说是用双蒸水单面浸泡两小时，有的说用甲醇处理两三分钟就可以了，到底哪种更适合我呢？
以上就是我的问题，谢谢^^

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1，标准蛋白？测试蛋白浓度用的标准品？我问你的目的蛋白分子量多大？
2，预染Marker是电泳及转膜后肉眼可见的蛋白分子量标准
内参你可以上网搜一下（内容比较多，你查到看一下就明白了）
3，呵呵，注意正负极。如果正负极没有问题，第二次用立春红染出来，说明你第一次染得不好
4，不同厂家PVDF膜活化方式不一样，比如Millipore的PVDF是无水甲醇浸泡15S就ok了
我就用这个条件活化PVDF膜
最后祝你实验顺利

谢谢你上次对我问题的回复.
我用的一抗是抗his-tag单抗，wb同时另做了一胶，跑page，page考染后在相应位置是有条带的，但wb没有结果。我们以前用相同条件做过wb，是用自制的血清，也是有带，只是表达量低，杂带较多。所以想用抗-his-tag进一步确定一下。沿用以前条件，换了一抗和二抗，却无结果。可能原因，请帮忙分析一下。十分感谢！

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要考虑一下蛋白降解的影响
另外要有His的阳性对照样品