【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

DONT[使用道具]
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5621

发表于 2013-3-30 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为120蛋白的WB，步骤如下：
1.配制8%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.电泳时间先用80v的跑，待mark分开之后再用120v的跑个50分钟。
3.再100v转膜100分钟，300mA的60分钟也跑过（也能看到，可是我们实验室的转膜机有时恒流，大部分恒压，没办法），现在还是用100v的跑。最后都能看到mark转过来！
4.转膜后TBST洗5min×3次。
5.用5%的脱脂奶粉室温封闭60-70分钟。
6.一抗浓度1:500（推荐1:200~1000），4°过夜，TBST漂洗10min×3次。
7.二抗浓度1：5000（推荐浓度，没找到说明书），室温60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
最后的结果是pvdf膜上没有看到荧光，（师姐们说，她们有做过没有看到荧光多压会也能曝出来）我现在看不到荧光的都是压30min左右，最后显影的时候还是看不到条带，今天不死心，把pvdf膜洗了洗，用丽春红染色能看到条带！（见图、、、）但是就是曝不出来！麻烦各位帮忙分析，指导下！谢谢、、、
另外还有麻烦你知道如何去除已经结合的一抗的配方，我想把这张膜从新孵一抗看看、、、谢谢！

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2013-3-30 17:21

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JK.jon[使用道具]
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5622

发表于 2013-3-30 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好，我的二抗说明书上标明：do not freeze ，可是我不小心把二抗放进了-20度，过了一夜才拿出来，现在还能用吗？谢谢！

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5623

发表于 2013-3-30 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问有没有做细胞膜蛋白的？用什么做内参呀？文献上有用Na-K ATP酶做内参的？但是这样的抗体实在太贵了，不知道能有更普遍，便宜的细胞膜的内参没？我做GSK-3β磷酸化的能出来，但是去除一抗二抗后总的GSK-3β却怎么也做不出来；如果先做总的，再做磷酸化的就都能出，不知道是怎么回事！

hold住[使用道具]
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5624

发表于 2013-3-30 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师你好，我遇到了一个棘手的问题：之前做WB也做了不少次，电泳时间一般是70V 30min，100V 1h 溴酚蓝就跑到底了，但是这次用了新配制的母液，刚煮的蛋白做WB，70V跑了 40分钟还算正常，可是换到100V跑分离胶时，却非常慢。已经跑了2H了还有一截子没到底。是母液的PH问题,还是我煮蛋白时的上样缓冲液加少了呢（自己感觉煮蛋白的时候，加的上样缓冲液不到4:1的比例，也没当回事）。求指点，感谢！

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发表于 2013-3-30 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是新手，打算做western blot，内参和marker是否根据测出的蛋白浓度而选择？可是我时间比较紧张，想一次把抗体和marker等试剂都买全了，这样就无法根据蛋白浓度选择内参和marker了，我做的是人TLR4，朋友有做鼠TLR4的，想问下，是否TLR4的分子量都差不多？能否根据他测得的蛋白浓度选择marker？如果不能，现在一头雾水，请高手指点一下，万分感谢！

子衿青青[使用道具]
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5626

发表于 2013-3-30 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我最近做western，总是曝不出条带，实在是找不到原因，但是内参很好，很齐也很亮
真是愁死了，最近一直在做，总也不出来好点的条带，麻烦帮忙分析一下原因，谢谢您！

tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-3-30 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

准备做western的新手，目的蛋白分子量较大，320多KD，关于浓缩胶和分离胶大小，内参的选择，以及转膜的电流和时间，想请教高手，本人刚接触实验，不懂的地方麻烦给予指导，不甚感激！