蛋白质与蛋白组学

我点的marker是彩色的，能在膜上清楚的显示出来，所以就没有丽春红染过！我看过一些资料，一般彩色marker转膜成功的话，不需要再用丽春红染色的。

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marker与你的样品不是一回事
如果你以marker来判断的话
除非系统非常稳定

老师，我的蛋白分子量分别是22KD、29KD、72KD、92KD,请问我配多大浓度的胶？转膜能一起转吗？电流和时间怎么定？谢谢

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12% 分离胶
分开转
22K、29K，300mA 恒流，转膜 30min
72,92K，300mA恒流，转膜 80min
湿转

LZ你好，我打算做NF-kB方面的，因为要看p65的转位，是不是要分别抽核蛋白和胞浆蛋白，再行WB？请问能否推荐相应的KIt啊？
是不是用kit后，一次抽提胞核和胞浆蛋白都能得到啊？谢谢

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胞浆、胞核抽提试剂盒即可

一抗博奥森action内参1:1000，二抗中杉抗兔1:3000,发光液用普利莱的超敏。
加上之后荧光不强，曝光3min，洗出的效果。再降抗体就没带了，要是按照这个清晰程度，还不如DAB敏感。
这是DAB显的。

大家帮忙判断下原因，谢谢！同学在动物所用和我一样的东西，他说用的就是国产二抗1:10000，说荧光很强，曝光就几秒钟。

压片结果

这是另外一个样品的，条件同上，是原核表达的蛋白，
荧光也是不强

看着目的带还可以，但是降一抗要去除非特异性条带就不清楚了，同等条件DAB的结果就很特异，dab的结果下图，条件同上。
另外向大家咨询下，胶片大家都是怎么扫图的，用扫胶片的扫描仪可以吗，上面是我用扫蛋白胶的bio-rad扫的，不清晰，看胶片能比这个清晰点。

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先把系统摸索好吧

最近刚开始做WB，一直用Actin练手，前几天结果还可以，最近几次，背景特别黑，条带在灯光下能看清，我们用的是ECL+，X光片手动显影，请教一下是什么原因，我自己查了一下，有的说是显影液中浸泡的时间太长了，显影液中应该浸泡到X光片达到什么程度啊？谢谢！

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用红光看看啊

封闭可以不用奶粉吗 谢谢老师

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可以

可以用BSA、Gelatin，Casein，无蛋白封闭液等等

各位麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为120蛋白的WB，步骤如下：
1.配制8%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.电泳时间先用80v的跑，待mark分开之后再用120v的跑个50分钟。
3.再100v转膜100分钟，300mA的60分钟也跑过（也能看到，可是我们实验室的转膜机有时恒流，大部分恒压，没办法），现在还是用100v的跑。最后都能看到mark转过来！
4.转膜后TBST洗5min×3次。
5.用5%的脱脂奶粉室温封闭60-70分钟。
6.一抗浓度1:500（推荐1:200~1000），4°过夜，TBST漂洗10min×3次。
7.二抗浓度1：5000（推荐浓度，没找到说明书），室温60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
最后的结果是pvdf膜上没有看到荧光，（师姐们说，她们有做过没有看到荧光多压会也能曝出来）我现在看不到荧光的都是压30min左右，最后显影的时候还是看不到条带，今天不死心，把pvdf膜洗了洗，用丽春红染色能看到条带！（见图、、、）但是就是曝不出来！麻烦各位帮忙分析，指导下！谢谢、、、
另外还有麻烦你知道如何去除已经结合的一抗的配方，我想把这张膜从新孵一抗看看、、、谢谢！

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丽春红染色看着还不错啊
检测什么蛋白？
抗体洗脱的配方有，但是不方便说

老师您好，我的二抗说明书上标明：do not freeze ，可是我不小心把二抗放进了-20度，过了一夜才拿出来，现在还能用吗？ 谢谢！

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可以用
没问题的

请问如果配胶时拔掉梳子之后胶孔里有胶（这个堵住孔的胶是和浓缩胶练成一块的不是碎的），然后上样时几乎每个孔都加不进样，以前从来没出现过，最近经常出现这种情况，同样的玻璃板和梳子配的胶胶孔的有可能被堵了，也可能不堵，请问是什么地方的原因？

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多加点APS与TEMED

请问有没有做细胞膜蛋白的？用什么做内参呀？文献上有用Na-K ATP酶做内参的？但是这样的抗体实在太贵了，不知道能有更普遍，便宜的细胞膜的内参没？我做GSK-3β磷酸化的能出来，但是去除一抗二抗后总的GSK-3β却怎么也做不出来；如果先做总的，再做磷酸化的就都能出，不知道是怎么回事！

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内参文献中有用GAPDH，beta-actin等
后面这个问题不懂