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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-30 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好，我遇到了一个棘手的问题：之前做WB也做了不少次，电泳时间一般是70V 30min，100V 1h 溴酚蓝就跑到底了，但是这次用了新配制的母液，刚煮的蛋白做WB，70V跑了 40分钟还算正常，可是 换到100V跑分离胶时，却非常慢。已经跑了2H了还有一截子没到底。是母液的PH问题,还是我煮蛋白时的上样缓冲液加少了呢（自己感觉煮蛋白的时候，加的上样缓冲液不到4:1的比例，也没当回事）。求指点，感谢！

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电泳槽中的缓冲液是否检查了？
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发表于 2013-3-30 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手，打算做western blot，内参和marker是否根据测出的蛋白浓度而选择？可是我时间比较紧张，想一次把抗体和marker等试剂都买全了，这样就无法根据蛋白浓度选择内参和marker了，我做的是人TLR4，朋友有做鼠TLR4的，想问下，是否TLR4的分子量都差不多？能否根据他测得的蛋白浓度选择marker？如果不能，现在一头雾水，请高手指点一下，万分感谢！

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TLR4我们就在做
不同公司的分子量是不同的
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发表于 2013-3-30 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我最近做western，总是曝不出条带，实在是找不到原因，但是内参很好，很齐也很亮
真是愁死了，最近一直在做，总也不出来好点的条带，麻烦帮忙分析一下原因，谢谢您！

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目的用哪里的抗体？
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发表于 2013-3-30 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
WB必须要有内参吗？我希望观察某种处理下GAPDH的变化，一般可用什么做内参？似乎有的文献中也没有指明用了什么做内参。

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目前的情况下都是要求有内参的
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发表于 2013-3-30 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问是干转好还是湿转好

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各有优劣
我们用湿转
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发表于 2013-3-30 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前辈好，我是在原代细胞和耐药细胞两株细胞中提取蛋白然后检测目的蛋白，但是曝光时原代细胞的条带却非常淡且细，耐药细胞的条带却异常深且粗（这个目的蛋白确实是在耐药细胞中高表达的）。是上样的问题么，上样两个都是35ug，一抗的浓度是1：37500（之前一次用的是1：25000但是背景很深所以稀释了一下）还是曝光时间短了？请老师指教啊~谢谢~

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内参呢？
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发表于 2013-3-30 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师你好，
我的蛋白是72KD, 5%浓缩胶， 10%分离胶，100V 2h，转膜200mA 2h. 奶粉封闭1h，一抗是santa cruz 1:200 (推荐1:100-1000), 4度过夜，TBST 5min 3次，二抗 1:2000 （推荐1:2000-10000），37度1h，TBST 15min 3次， DAB显色. 结果actin有条带，目的蛋白没有条带，背景清晰。丽春红染膜，目的蛋白周围有条带（所以这个是目的蛋白的条带吗，还是显示的是什么）。求解答！
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发表于 2013-3-30 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师，您好。我想问一下。我的目的条带的分子量分别为37、54、140KDa，我应该用怎样百分之多少的分离胶和浓缩胶。能在一张膜上面跑吗？，电泳和电转条件建议该怎么设置？谢谢
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发表于 2013-3-30 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问各位大侠，
啥时候选择磷酸化的一抗？啥时候选择非磷酸化的一抗？
貌似磷酸化的一抗还要贵一些。
菜鸟膜拜！！
回答本帖的肯定交好运，发大财！
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tianmei001[使用道具]
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 小中大

老师 ，我做western转膜时不小心切多了一大块PVDF膜，而且已经泡在甲醇里了，今天是用不了这个膜了。我想请教您——这个膜明天还能用吗？还是只能扔掉？谢谢！
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