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标题:【讨论帖】western blot问题解答

yychen[使用道具]
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电泳槽中的缓冲液是否检查了?

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电泳槽中的电泳液没问题啊,都是按以前的配方配的,两块板中间的电泳缓冲液都是满的,外槽的缓冲液也是足够的。TRIS hcl的PH定的不准会影响么?
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bamboo16[使用道具]
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各位麻烦帮忙分析下原因!最近在做分子量为120蛋白的WB,步骤如下:
1.配制8%的分离胶,再灌注5%的分离胶。
2.电泳时间先用80v的跑,待mark分开之后再用120v的跑个50分钟。
3.再100v转膜100分钟,300mA的60分钟也跑过(也能看到,可是我们实验室的转膜机有时恒流,大部分恒压,没办法),现在还是用100v的跑。最后都能看到mark转过来!
4.转膜后TBST洗5min×3次。
5.用5%的脱脂奶粉室温封闭60-70分钟。
6.一抗浓度1:500(推荐1:200~1000),4°过夜,TBST漂洗10min×3次。
7.二抗浓度1:5000(推荐浓度,没找到说明书),室温60-70分钟,TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
最后的结果是pvdf膜上没有看到荧光,(师姐们说,她们有做过没有看到荧光多压会也能曝出来)我现在看不到荧光的都是压30min左右,最后显影的时候还是看不到条带,今天不死心,把pvdf膜洗了洗,用丽春红染色能看到条带!(见图、、、)但是就是曝不出来!麻烦各位帮忙分析,指导下!谢谢、、、
另外还有麻烦你知道如何去除已经结合的一抗的配方,我想把这张膜从新孵一抗看看、、、谢谢!

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当时没有看到荧光压片了也是可以曝出来的 不过一般超过半小时就没有意义了 检查下ECL 不同批次ECL效果不一样 洗脱一抗重新孵育可以用膜再生液 祝实验顺利
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kuaizige[使用道具]
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lxh031[使用道具]
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我内参还没有做出来,问题也不知道出在哪里,麻烦你给看看,
这是第一次做的beta-actin,问题很多,转膜可能存在气泡,没洗干净
跑胶,浓缩5%30min左右,分离12%60min左右转膜时间300mA,1h,封闭5%nofat milk, tbst稀释,1h,室温;


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一抗santa 1:200,TBST稀释,4℃过夜; TBST洗膜4*5min;
二抗博士德,1:2000,TBST稀释,室温1h;TBST洗膜4*5min。PIERCE supersignal显影5min。


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这张是时隔两个月后做的,左边1-5孔样品和上面那张图一样,6孔和7孔样品新制备
(制备方法:
上样10ul, 样品处理:50mg组织,反复 冻融两次,冰上研磨,加200ulRIPA裂解液(自己配置,1%triton,1mMEDTA, 1mMPMSF, 50mMTRIS-HCL,pH8.0, 0.1%SDS)冰上研磨,匀浆机匀浆2次,10s/次,冰上孵育20min,匀浆2次,10s/次,冰上孵育20min,超生5min,冰上孵育15min,4℃,12000g,离心20min,取上清,分装,加Loading buffer 煮沸10min,-20℃保存。煮完貌似有点沉淀,但上样前,煮了3min,沉淀似乎又溶解了)

跑胶,浓缩5%30min左右,分离12%60min左右转膜时间300mA,1h,封闭5%nofat milk,tbst稀释;

封闭4℃过夜(之前室温封闭1h)

一抗santa 1:200,TBST稀释, 室温4h(第一次是4°过夜的);

TBST洗膜3*10min(第一次是4*5min);

二抗博士德,1:2000,TBST稀释,室温1h;

TBST洗膜3*10min。PIERCE supersignal显影10min。
第6孔和第七孔明明是一样的样品,结果是6没有,7有一条浅浅的带,不知道什么原因;
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所以又将6和7的样品重新按上面步骤做了一遍,上样量都是一样的,抗体都是新配置的,转膜液,TBST,电极缓冲液都是之前配置的母液稀释的,要说变化的条件,应该是:转膜时滤纸换了新的,一抗4度过夜了,二抗是先在室温30min, 4° 3h,室温30min,以前孵育用12cm培养皿,这次为了节省抗体用了5cm培养皿,膜正好能放下.其他都没怎么变的;
结果ECL30min,还是没有结果,一片空白,上面那张10min就有结果了;费解啊。。。。。。下面我把转膜后丽春红染得图放上来,手机照的有一点模糊


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下面是转膜完的胶银染图片


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20KD左右的蛋白似乎都转过去了。转膜完我发现滤纸上20kd的marker很深,应该转过了~~actin分子量43kd,应该不至于转过了吧;

曝光后的膜染了丽春红,挺干净的,我记得以前敷过抗体后,结合抗体的地方经染色后有一条很深得条带的~~这个没有,我猜测一抗结合的不好,不知道对不对,下图


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老师,我想请教一下,最近我在做小鼠某个分泌蛋白在各组织中的表达水平,包括脂肪组织,脑,肌肉,肝脏等,BCA严格定量后,跑出来的β-actin很不齐,然后我根据灰度重新调整上样量,最后β-actin还是和之前一样很不齐,需要怎么优化这个实验?另外我想问一下骨骼肌样品需要选择哪个内参?谢谢!
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