小中大这张是时隔两个月后做的,左边1-5孔样品和上面那张图一样,6孔和7孔样品新制备
(制备方法:
上样10ul, 样品处理:50mg组织,反复 冻融两次,冰上研磨,加200ulRIPA裂解液(自己配置,1%triton,1mMEDTA, 1mMPMSF, 50mMTRIS-HCL,pH8.0, 0.1%SDS)冰上研磨,匀浆机匀浆2次,10s/次,冰上孵育20min,匀浆2次,10s/次,冰上孵育20min,超生5min,冰上孵育15min,4℃,12000g,离心20min,取上清,分装,加Loading buffer 煮沸10min,-20℃保存。煮完貌似有点沉淀,但上样前,煮了3min,沉淀似乎又溶解了)
跑胶,浓缩5%30min左右,分离12%60min左右转膜时间300mA,1h,封闭5%nofat milk,tbst稀释;
封闭4℃过夜(之前室温封闭1h)
一抗santa 1:200,TBST稀释, 室温4h(第一次是4°过夜的);
TBST洗膜3*10min(第一次是4*5min);
二抗博士德,1:2000,TBST稀释,室温1h;
TBST洗膜3*10min。PIERCE supersignal显影10min。
第6孔和第七孔明明是一样的样品,结果是6没有,7有一条浅浅的带,不知道什么原因;