小中大你好，我的一抗是Abcam的（ab74734，兔多抗whole serum），二抗Santa，内参博奥森的Beta-actin。目的和内参都做不出，很是着急，不知哪些环节可能有问题。
组织：人心肌组织，目的蛋白是膜蛋白，分子量97KD，用碧云天P0013裂解液提取全蛋白，测浓度20-30mg/ml。
上样量：20微升
电泳仪：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra
电泳：5%浓缩胶60v、30min，8%分离胶120v、60min（胶用考马斯亮蓝染色后，目的分子量周围条带清晰分明）
转膜：冰浴恒流300mA 60min（0.22的PDVF膜,1.5mm厚胶 转膜后染胶没有条带，染膜隐隐约约有，但不确定是不是）
封闭：碧云天封闭液室温封闭1小时
一抗：碧云天一抗稀释液稀释1:1000（说明书说1:300到1:4000），摇床上4度过夜
内参稀释1:1000（说明书1:1000到1:1500）
洗膜：TBST洗10min*3遍
二抗：碧云天二抗稀释液稀释1:2000，摇床上室温摇1h
洗膜：TBST洗10min*3遍
显色：ECL显色未见荧光，压片10分钟也什么都没有（稀释过的二抗直接加发光剂显影定影没有问题）
请问可能是哪些环节有问题？
1.组织在-80℃放了半年，有无影响？提取蛋白的方法有无问题，膜蛋白能用总蛋白做出来吗？
2.心肌组织是不是不能用Beta-actin作内参？
3.一抗-20℃放了4个月，期间一共就冻融过3次，会不会已经失效，如何验证？
4.转膜条件有无问题？转膜液配方：Tris 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，SDS 1g，加水至1000ml，有无问题？
5.Beta-actin和GAPDH 适合的转膜条件是多少？
