小中大我内参还没有做出来，问题也不知道出在哪里，麻烦你给看看，
这是第一次做的beta-actin，问题很多，转膜可能存在气泡，没洗干净
跑胶，浓缩5%30min左右，分离12%60min左右转膜时间300mA,1h，封闭5%nofat milk， tbst稀释，1h，室温；
一抗santa 1:200，TBST稀释，4℃过夜； TBST洗膜4*5min;
二抗博士德，1:2000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜4*5min。PIERCE supersignal显影5min。
这张是时隔两个月后做的，左边1-5孔样品和上面那张图一样，6孔和7孔样品新制备
（制备方法：
上样10ul, 样品处理：50mg组织，反复 冻融两次，冰上研磨，加200ulRIPA裂解液（自己配置，1%triton，1mMEDTA, 1mMPMSF, 50mMTRIS-HCL,pH8.0, 0.1%SDS）冰上研磨，匀浆机匀浆2次，10s/次，冰上孵育20min，匀浆2次，10s/次，冰上孵育20min，超生5min，冰上孵育15min，4℃，12000g，离心20min,取上清，分装，加Loading buffer 煮沸10min，-20℃保存。煮完貌似有点沉淀，但上样前，煮了3min，沉淀似乎又溶解了）
跑胶，浓缩5%30min左右，分离12%60min左右转膜时间300mA,1h，封闭5%nofat milk，tbst稀释；
封闭4℃过夜（之前室温封闭1h）
一抗santa 1:200，TBST稀释， 室温4h（第一次是4°过夜的）；
TBST洗膜3*10min（第一次是4*5min）;
二抗博士德，1:2000，TBST稀释，室温1h；
TBST洗膜3*10min。PIERCE supersignal显影10min。
第6孔和第七孔明明是一样的样品，结果是6没有，7有一条浅浅的带，不知道什么原因；
所以又将6和7的样品重新按上面步骤做了一遍，上样量都是一样的，抗体都是新配置的，转膜液，TBST，电极缓冲液都是之前配置的母液稀释的，要说变化的条件，应该是：转膜时滤纸换了新的，一抗4度过夜了，二抗是先在室温30min, 4° 3h,室温30min，以前孵育用12cm培养皿，这次为了节省抗体用了5cm培养皿，膜正好能放下.其他都没怎么变的；
结果ECL30min,还是没有结果，一片空白，上面那张10min就有结果了；费解啊。。。。。。下面我把转膜后丽春红染得图放上来，手机照的有一点模糊
下面是转膜完的胶银染图片
20KD左右的蛋白似乎都转过去了。转膜完我发现滤纸上20kd的marker很深，应该转过了~~actin分子量43kd，应该不至于转过了吧；
曝光后的膜染了丽春红，挺干净的，我记得以前敷过抗体后，结合抗体的地方经染色后有一条很深得条带的~~这个没有，我猜测一抗结合的不好，不知道对不对，下图
麻烦你帮我分析一下是什么原因，接下来怎么改进实验~~
=================================
首要一点：就是把电泳跑好
1、样品中似乎看着有沉淀或者降解了
2、从marker来看，胶也不是很好
