蛋白质与蛋白组学

不好意思说错了~我的意思就是目的蛋白~分子量是：44287Da

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12%分离胶
半干转膜：1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，1h20min
湿转：300mA，恒流，1h

不好意思说错了~我的意思就是目的蛋白~分子量是：44287Da

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重新检查你的蛋白提取buffer
回检一下看看你的目的蛋白有没有降解

老师您好，我做了几次WB，结果都不好，我是做的FABP蛋白和beta-actin，分别是17KD和43KD，电泳条件是70V和120V，转膜两个小时，我怕转不上去，用的两张膜，转完膜marker上有清晰的彩虹条带，然后用一抗1：2000和1：500.二抗1：5000分别孵育4小时和1小时，洗膜3次，但是加了AB液后根本看不到荧光，压出的片子什么都没有，请问下是什么原因呀？谢谢。

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1，beta-actin出结果了吗？如果没出结果说明你整体系统都还存在这问题
2，转膜时间太长，17K的目的蛋白与43K的beta-actin我建议你用半干转膜，30min
3，调整一抗的浓度至1：500和1：1000做预实验
祝你好运

beta-actin也没有结果哦。。。现在我都灰心得不行了，之前还做出来过，这几次就做不出来了。蛋白没有问题，做了BCA蛋白测定的。
您说的调整一抗的浓度是FABP用1：500，actin用1：1000吗？
什么叫半干转膜呀，老师能说得详细些吗？
非常感谢老师！

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半干转膜是什么你要自己上网查查
这些东西很好查的
先做beta-actin
等这个做出来之后再做目的蛋白
要不然你同时做的话还要浪费很多试剂、抗体和时间

谢谢老师对我前面的指教，今天看了考染的结果，大家一致认为是我提取的组织蛋白没提好
（我想可以能问题出在以下我的操作步骤里吧：
1，我提的是大鼠足底皮肤蛋白，方法是剪取长方形1.5X1.5cm皮肤表皮组织置500ulRIPA+7ul PMSF 玻璃匀浆器中匀浆40分钟，
2，4度12000转离心20分钟，取上清，
3，上清：上样缓冲液=4：1混合，
4，80-90度开水煮10分钟，
5，-20度分装保存，）
这里想请教老师：我加的裂解液和蛋白抑制剂有问题吗（我的目的蛋白是BETA内啡肽和IL-1BETA）？离心时间上有问题吗？还有煮蛋白有没有问题？盼老师给予解答，不胜感谢！

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你算是问对人了
我刚提了人的皮肤组织蛋白
今天刚跑了电泳
觉得提的很不错
你的匀浆时间太长了，另外匀浆的时候是在冰水混合物环境中吗？
PMSF 1~3mM就可以
后续步骤没什么大问题
在匀浆前把组织剪碎
你的组织称重了吗？
我觉得你个组织加500ul裂解液有些少了

请问WB电泳电压，转膜电压可有一个大体估计原则？

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原则是有的
要根据经验来调整条件
具体的说起来太多了
表达不清楚

你算是问对人了
我刚提了人的皮肤组织蛋白
今天刚跑了电泳
觉得提的很不错
你的匀浆时间太长了，另外匀浆的时候是在冰水混合物环境中吗？
PMSF 1~3mM就可以
后续步骤没什么大问题
在匀浆前把组织剪碎
你的组织称重了吗？
我觉得你个组织加500ul裂解液有些少了

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是啊，我上次匀浆过程中忘了提前打开离心机，等离心机降温等了好久，
我是在冰上匀浆的
组织没有称，我也不知道有多重，感觉就是表皮组织太硬了，要匀浆好长时间，我是先剪碎的，很想请教老师你是怎样加裂解液和蛋白酶抑制剂的？