蛋白质与蛋白组学

内参条带很清楚，背景清晰。目的蛋白是4度过夜的。然后我又做了一个目的蛋白，46KD（内参43KD），有条带，很清 晰。但是之前的两个蛋白（一个71KD，一个68KD），都没有条带。

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可能目的一抗不工作喽

楼主，您好，我现在做的蛋白里有184KDa，100KDa，52KDa，还有内参是GAPDH，分子量才35KDa，请问我是否可以在一板胶里跑开这些蛋白，什么浓度最合适，如果实在不行，分成两种浓度的胶跑，最后可以放在一起分析吗？比如184，和100的用低浓度跑，52和内参高浓度跑，最后的结果可以一起分析吗？

还有就是184这么大的蛋白，转膜多久可以转上呢？谢谢楼主

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1、转膜，184Kd， 300mA 恒流，湿转，恒流2h
2、分开跑吧，184KD的可以用beta-tubulin

请教老师：
我的目标蛋白越40kD，10%的胶。电泳80V跑30min，在100跑90min。转膜恒流80mA 90min，电泳液和转膜液都是新配的，用的是普利莱公司的10×浓缩液。甲醇现加。
膜用的是PVDF膜，转完膜后5%脱脂奶粉封闭1h。
加一抗。β-actin用的是碧云天的，抗体及抗体稀释液。1:1000稀释
其他的一抗用的是abcam公司的，用封闭液稀释。这次用的是1:200稀释的。
TBST用的是普利莱公司的10×封闭洗涤缓冲液。
一抗袋4℃ 静置过夜，第二天拿出来再室温摇床1h。
一抗孵育完后再TBST中洗三次，每次20min
二抗用的是碧云天的HRP山羊抗鼠。1:1000用TBST稀释。
室温摇床1h。
再用TBST洗三次，每次20min。

结果是这样的：目标蛋白大小24kd左右 但是抗体说明书上说会在43kd左右观察到条带。

我有几个问题：
1.碧云天的一抗稀释液除了稀释β-actin之外，还能不能用来稀释其他的一抗？
2.为什么显影里β-actin的背景这么黑？
3.右侧目标蛋白出现了很多条带是怎么回事啊？？

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1、可以用来稀释其他一抗
2、调整一抗与二抗的浓度
3、调整一抗稀释度

这是我之前做的β-actin


在暗室肉眼可以看到中间深色的条带，很亮，看不见背景发光，但是我X光片就在膜上碰一下，拿去显影就出现这样的结果了。是什么原因导致的呢？

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1、洗膜次数增加几次
2、一抗、二抗稀释度加大