【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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5711

发表于 2013-4-3 10:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的内参actin跑出来是这样的：

附件

2013-4-3 10:23

13538275.snap.jpg (20.98 KB)

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5712

发表于 2013-4-3 10:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

而同一实验室其他人（同样的actin一二抗）跑出来的actin是这样的：

请教一下：
那个是我的目的蛋白吗？感激不尽！！谢谢！！

附件

2013-4-3 10:23

46337405.snap.jpg (8.01 KB)

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5713

发表于 2013-4-3 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也来提问一个吧，溴酚蓝指示剂不是直线啊怎么，貌似中间跑的慢，两边跑的快，和拱形似的，另一块儿胶上和抛物线似的，为什么啊

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5714

发表于 2013-4-3 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也来提问一个吧，溴酚蓝指示剂不是直线啊怎么，貌似中间跑的慢，两边跑的快，和拱形似的，另一块儿胶上和抛物线似的，为什么啊

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可以在加蛋白的左右两边，再加上等量或一半的上样缓冲液，应该可避免类似的情况。

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5715

发表于 2013-4-3 10:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好！最近做ｈｅｓ１蛋白，分子量３０，用的转膜条件是２５０ｍＡ转８０分钟，用的０.４５ｕｍ的ＰＶＤＦ膜。做了几次ａｃｔｉｎ都出来的不错，但是目的蛋白总是没有条带。抗体用的ＥＰＩ的浓度１:１０００做的。做了多次，只有一次出来了很模糊的影子，希望楼主给点建议！谢谢！

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5716

发表于 2013-4-3 10:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师，有问题请教，刚开始学做western blot ,按照实验室之前的流程，做出来的结果是

上样20ul, 浓度3，上样量就是60ug左右，跑胶，2.5小时，80V恒压，转膜 300mA,1小时，封闭5% milk-tbst，2小时摇床一抗bcl-2,比例1:500，TBST稀释，4度过夜；TBST洗膜3*10min，二抗，1:1000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜3*10min。显影10min。结果只出现单个的亮条，不知道是怎么回事：

附件

2013-4-3 10:26

30649064.jpg (33.15 KB)

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5717

发表于 2013-4-3 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好！从咱们的论坛上得知您是Western-blot专家，看到您以前也回答过关于细胞mTOR和p-mTOR的问题，我现在的问题是“做了很长时间hela细胞mTOR和p-mTOR Western-blot就是不出带”，能想到的存在的各类问题和可能调整的实验条件都尝试过了，还是做不出来。我们猜测可能是hela细胞表达mTOR和p-mTOR过少或者不同癌细胞表达mTOR和p-mTOR量不同。这样，我们分别用Western-blot针对hela、NIH3T3、SIHA、SW116、CAPAV-1等细胞检测了mTOR和p-mTOR，从SDS-PAGE考马斯亮兰条带看这些细胞均在marker 250-300kD之间的蛋白条带很浅（有的重复试验还没有条带），但是Western-blot都没有杂出来。抗体是cst公司的。

需要问您的问题是：（1）有的文献说要用对数生长期的细胞，我们用的是接种后24h细胞（也用过48h细胞），还做过胰岛素刺激细胞及不同厂家的hela，都没有杂出来，请问和细胞周期及细胞状态有关吗？请问您是在什么时期收蛋白做Western-blot的，用什么裂解液？

（2）请问在考马斯亮兰条带很浅或几乎看不见的情况下能杂出清晰的Western-blot带吗？

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5718

发表于 2013-4-3 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主，你好，非常感谢你的耐心回答，我最近做了两次预实验，有两个蛋白的抗体，做了之后出来的条带都不在抗体说明书里给的地方

上是30,40,50，抗体说明书给的observed的分子量是63KDa，predicted是115KDa，但是我做了两次都在30和40之间，我的抗体是santa的多抗，蛋白来自培养的大鼠神经元细胞，文献中说在大鼠里检测到的分子量是100到130之间（用的abcam的多抗），我的蛋白是前一天提了，第二天做的western，我想知道是蛋白降解了，还是抗体不好，非常感谢，我最近很迷惑

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2013-4-3 10:27

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5719

发表于 2013-4-3 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位好，我是新手，正准备做western，不过测的是人血浆中的某种蛋白，分子量30KD左右，看过一些文章，但提到的标本都是组织或细胞，没有涉及血浆的，不知道要选什么内参合适，请教各位了，急需，谢谢!

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发表于 2013-4-3 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有蛋白考马斯亮蓝染胶图吗？

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没有，不过我现在初步估计是转膜用的夹子的海绵用久了变薄导致三明治结构夹的不紧，蛋白从中间缝隙流动了，我现在让我这边的研究生三明治里多加了块海绵，他做出来的结果挺好的，我最近没做表达了，所以还没再尝试。

等过段时间我再来向老师请教O(∩_∩)O~谢谢

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