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标题:【讨论帖】western blot问题解答

fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-4-3 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前辈你好：
我是新手，刚开始WB，我的蛋白分子量是156kd，能不能给推荐一下电泳的时间，电压。转膜的时间，电压（我们实验室半干转和湿转都可以做）；
我配的都是10x的电泳缓冲液和转膜缓冲液，有的师兄说可以直接使用然后回收，有的师兄说稀释为一倍的使用，自己有点迷茫了。请前辈指教
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-4-3 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主您好，我想请教能使背景干净或变淡一点的方法。下面是我做的western blot 条带。

一抗1：1000，4度，16小时，二抗 1：1000，室温，1小时。
曝光使用ECL+， 因为我要看的条带是120kDa, 目的条带不清楚，所以在暗盒和developer中的时间长一点了。
能否给个建议改善哪一方面再试一试呢？


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2013-4-3 10:29
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-4-3 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我最近做western有个问题，就是我的marker跑出来的条带颜色很浅而且很宽，以前也是用这个marker也没有这个问题，应该是最近的胶的问题，但是不知道问题在哪里，求指导！谢谢！
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发表于 2013-4-3 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

配裂解液忘记调pH值了，提取完一测才5.9,会有很大影响吗？
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-4-3 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

需要联系方式请站内短信息联系

求大神帮我分析原因啊！

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上样完了跑电泳大概八分钟的样子就漏样了，开始怀疑浓缩胶没凝好，后来加长浓缩胶凝缩时间，还是不行；然后怀疑是制胶问题，然后换人制胶（上样、把梳子还是我），跑起来还是漏。到底是什么原因呢？
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发表于 2013-4-3 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好！
最近做wb遇到了很严重的瓶颈，原来能出来的所有条带，现在一个都出不来，β-actin 的信号也很弱，希望您能够给一些建议：
需要蛋白是40-190 kD 的蛋白，跑胶和电泳时按照前面跟您讨论的结果做的，湿转后，用甲醇活化，可以在目标蛋白区域看到很明显的条带，可是在敷完抗体曝光以后，β-actin 的信号很弱，继续曝光后，原本有的信号也没有了，而目标蛋白区域直接未出现条带。
请问老师，这问题可能会出现在哪里？
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发表于 2013-4-3 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二抗用1:10000

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您好，我用了1:10000的稀释比还是黑漆漆的一片，请问是什么原因啊
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-4-3 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看上去好像是电泳时没浓缩好，浓缩胶是不是太短了？导致分离效果不好。

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浓缩胶不短啊，而且其他泳道也没出现这种情况
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发表于 2013-4-3 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请教一下关于样品缓冲液的问题，我们实验室一直用的是fermentas的5X protein loading buffer 加入5%比例的巯基乙醇，然后在100度加热5分钟 ，结果时好时坏，我觉得这步应该很关键，想问您是怎么处理样本的？还有其他更好的样品处理液吗？谢谢
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发表于 2013-4-3 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好，我有两个问题：
1：为什么我跑胶（15%的分离胶）小分子蛋白（17KD）几乎都是如下图而不是直的，只有偶尔是值的，但是大蛋白都是直的，marker也是这样的，30K及以上就是直的？是30%AB的问题么？
2：我15孔的胶，17K的蛋白。marker放最左边的孔，标为1孔道，之后依次为2-15孔。western检测偶尔会出现某张膜上一边或者两边的孔中没有信号，中间的反而有，即2、3、4以及13、14、15孔中没信号（都是loarding,理论上上样量都差不多）怀疑是转膜问题，但是marker放最最左边的1孔道转膜没问题。奇怪的是再次重复就好了。我知道这种问题的解决方法之一是重做，但是这样很不爽，偶尔出个问题却不能解决，且一个月中出现三次了，不定时出个问题很抓狂。

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系统不稳定
小分子量条带是不太直的
想直的话用梯度胶系统
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