蛋白质与蛋白组学

老师，你好，我的问题是我做的WB的是大鼠组织，一抗是安博的兔多抗TGF-β1，40几Kd，货号C0340，网址 cuturl('http://www.anbobio.com/product_detail.asp?sort_id=54&shop_id=2185&page=1')
10%的分离胶，5%的浓缩胶。一抗浓度是 1:500，二抗浓度是1:5000，0.45μm PVDF膜（索莱宝的），转膜条件：80V，1h。5%脱脂牛奶封闭1h。一抗4℃孵育过夜（总量1ml保险膜上，倒扣）。二抗（5%脱脂牛奶稀释）封闭1h。

每个孔，蛋白上样量是一致的。
原先一抗浓度用1:2000也没做出来，后改为1:1000也不是很理想。
想请老师帮我分析下原因，需做哪些改进？？O(∩_∩)O谢谢~~~~~

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呵呵
这个抗体我用过
效果一般
调整一下二抗稀释度试试吧

您好，我的目的蛋白是92kD，下图是我在不同时间跑的两个条带，请问最下面70左右的这一排是我的目的蛋白吗？

这是扫出来的条带，但肉眼看NC 膜有点奇怪：

我的内参actin跑出来是这样的：

而同一实验室其他人（同样的actin一二抗）跑出来的actin是这样的：

请教一下：
那个是我的目的蛋白吗？感激不尽！！谢谢！！

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70K与100K之间的可能是你的目的条带哦
用的marker是？

楼主你好！最近做ｈｅｓ１蛋白，分子量３０，用的转膜条件是２５０ｍＡ转８０分钟，用的０.４５ｕｍ的ＰＶＤＦ膜。做了几次ａｃｔｉｎ都出来的不错，但是目的蛋白总是没有条带。抗体用的ＥＰＩ的浓度１:１０００做的。做了多次，只有一次出来了很模糊的影子，希望楼主给点建议！谢谢！

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有图片吗？
目的蛋白的一抗试了几个稀释度？

老师，有问题请教，刚开始学做western blot ,按照实验室之前的流程，做出来的结果是：

上样20ul, 浓度3，上样量就是60ug左右，跑胶，2.5小时，80V恒压，转膜 300mA,1小时，封闭5% milk-tbst，2小时摇床一抗bcl-2,比例1:500，TBST稀释，4度过夜；TBST洗膜3*10min，二抗，1:1000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜3*10min。显影10min。结果只出现单个的亮条，不知道是怎么回事

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上样量太大了

您好！从咱们的论坛上得知您是Western-blot专家，看到您以前也回答过关于细胞mTOR和p-mTOR的问题，我现在的问题是“做了很长时间hela细胞mTOR和p-mTOR Western-blot就是不出带”，能想到的存在的各类问题和可能调整的实验条件都尝试过了，还是做不出来。我们猜测可能是hela细胞表达mTOR和p-mTOR过少或者不同癌细胞表达mTOR和p-mTOR量不同。这样，我们分别用Western-blot针对hela、NIH3T3、SIHA、SW116、CAPAV-1等细胞检测了mTOR和p-mTOR，从SDS-PAGE考马斯亮兰条带看这些细胞均在marker 250-300kD之间的蛋白条带很浅（有的重复试验还没有条带），但是Western-blot都没有杂出来。抗体是cst公司的。

需要问您的问题是：（1）有的文献说要用对数生长期的细胞，我们用的是接种后24h细胞（也用过48h细胞），还做过胰岛素刺激细胞及不同厂家的hela，都没有杂出来，请问和细胞周期及细胞状态有关吗？请问您是在什么时期收蛋白做Western-blot的，用什么裂解液？

（2）请问在考马斯亮兰条带很浅或几乎看不见的情况下能杂出清晰的Western-blot带吗？

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1、mTor与p-mTor经常做，用的是CST的抗体，这两个蛋白很好检测哦，表达量很大
2、用多大浓度的分离胶跑完电泳后进行的考染？

楼主，你好，非常感谢你的耐心回答，我最近做了两次预实验，有两个蛋白的抗体，做了之后出来的条带都不在抗体说明书里给的地方，
比如这个，我的marker最下面的条带是25，然后往上是30,40,50，抗体说明书给的observed的分子量是63KDa，predicted是115KDa，但是我做了两次都在30和40之间，我的抗体是santa的多抗，蛋白来自培养的大鼠神经元细胞，文献中说在大鼠里检测到的分子量是100到130之间（用的abcam的多抗），我的蛋白是前一天提了，第二天做的western，我想知道是蛋白降解了，还是抗体不好，非常感谢，我最近很迷惑

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试过阳性样品吗？

各位好，我是新手，正准备做western，不过测的是人血浆中的某种蛋白，分子量30KD左右，看过一些文章，但提到的标本都是组织或细胞，没有涉及血浆的，不知道要选什么内参合适，请教各位了，急需，谢谢!

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我自己没有做过血浆的内参
但是我知道有人用过beta-actin

前辈你好：
我是新手，刚开始WB，我的蛋白分子量是156kd，能不能给推荐一下电泳的时间，电压。转膜的时间，电压（我们实验室半干转和湿转都可以做）；
我配的都是10x的电泳缓冲液和转膜缓冲液，有的师兄说可以直接使用然后回收，有的师兄说稀释为一倍的使用，自己有点迷茫了。请前辈指教

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1、电泳完成后先考染胶
2、湿转，300mA 恒流，2h30min

楼主您好，我想请教能使背景干净或变淡一点的方法。下面是我做的western blot 条带。

一抗1：1000，4度，16小时，二抗 1：1000，室温，1小时。
曝光使用ECL+， 因为我要看的条带是120kDa, 目的条带不清楚，所以在暗盒和developer中的时间长一点了。
能否给个建议改善哪一方面再试一试呢？

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把二抗浓度降下来，稀释度试试1:10000

配裂解液忘记调pH值了，提取完一测才5.9,会有很大影响吗？

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肯定有很大影响的撒