蛋白质与蛋白组学

老师您好！
最近做wb遇到了很严重的瓶颈，原来能出来的所有条带，现在一个都出不来，β-actin 的信号也很弱，希望您能够给一些建议：
需要蛋白是40-190 kD 的蛋白，跑胶和电泳时按照前面跟您讨论的结果做的，湿转后，用甲醇活化，可以在目标蛋白区域看到很明显的条带，可是在敷完抗体曝光以后，β-actin 的信号很弱，继续曝光后，原本有的信号也没有了，而目标蛋白区域直接未出现条带。
请问老师，这问题可能会出现在哪里？

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用的是ECL孵育后，胶片曝光吗？
如果是，ECL厂家是哪里的？

您好，我用了1:10000的稀释比还是黑漆漆的一片，请问是什么原因啊

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继续稀释二抗

老师您好！
最近做wb遇到了很严重的瓶颈，原来能出来的所有条带，现在一个都出不来，β-actin 的信号也很弱，希望您能够给一些建议：
需要蛋白是40-190 kD 的蛋白，跑胶和电泳时按照前面跟您讨论的结果做的，湿转后，用甲醇活化，可以在目标蛋白区域看到很明显的条带，可是在敷完抗体曝光以后，β-actin 的信号很弱，继续曝光后，原本有的信号也没有了，而目标蛋白区域直接未出现条带。
请问老师，这问题可能会出现在哪里？


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用的是ECL孵育后，胶片曝光吗？
如果是，ECL厂家是哪里的？

用 的是自己配置的ECL发光液，用胶片曝光，也能爆出来条带，就连β-actin都很细，或者就是出不全，用的是abcam的抗体，1:5000的二抗，今天试了个1:2000，出来的条带还是一样的。

呵呵
这个抗体我用过
效果一般
调整一下二抗稀释度试试吧

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调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参…… 那TGF-β1单抗，版主推荐的是哪家公司的？ 跟大鼠组织反应的。
哈哈还有个问题，就是细胞蛋白大概每孔需上多少的量？蛋白总量和体积？我用的是1mm的玻璃板，1mm的梳子，我上了30μg，用抗体孵育好，发现没测出来。想问下版主，细胞蛋白，怎么上最少的蛋白量测出我想要的结果？改用0.75mm的梳子？？上多少μg或μl？？ 同样条件下，组织50μg能做出来。